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终止液是2mol/L的H2SO4，将酶破坏，蛋白变性，从而改变颜色：由蓝变黄。

本人用一重组蛋白（该蛋白存在于人体的血清中）制备了该蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，并且单多克隆抗体都用竞争法证实了可以识别血清中该蛋白的天然形式。
目前，我用该蛋白的鼠源性单抗来包被ELISA板子，5%BSA37度封闭二小时后，洗涤四次后将板子分三个组加入抗原：其中一个组中加入的是我重组的蛋白，另一个组为用其它方法证实含该蛋白的人体内血清，最后一个组加入PBS。37度一小时后洗涤四次后每孔加入我制备的兔源性多抗。37度一小时洗涤六次后我再加入酶标记的抗兔的抗体37度40分钟后洗涤六次后TMB显色。
问题就在我显色后所有的孔都是阳性，其中以抗原为我的重组蛋白组与PBS组OD值最高，两组都可以达到1.8以上，而加入的抗原为人体血清组低，为0.6-1.0不等。
后面我优化条件，封闭液用过5%的脱脂奶粉，2%的BSA，包被的单抗浓度摸了梯度，加入的多抗也摸了梯度，酶标的抗体也摸了梯度。结果都没有改变，连趋势每次都是一样以重组蛋白组与PBS组OD最高。
今天我还试着把抗原换成其它蛋白也做出了强阳性？
请教各位高手，我的ELISA该如何往下面做了啊，是不是我的抗体本身有问题呢？
对了，我包被用的单抗是用GE公司的预装柱纯化的，很纯，在考染中是看不到一条杂带的。

双抗体夹心法：
(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为：将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅。百特纯大分子Meretciel的测激素的ELISA试剂盒有些就是竞争法的。夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。以双抗体夹心法为主，下面以双抗体夹心法为例讲解原理（双抗原夹心法类似）：首先将具有专一性之抗体包被（coating）于酶标板上，检测时加入待测样本，样本中若含有待测抗原，则会与酶标板上包被的抗体专一性结合，然后加入另一种针对待检抗原的抗体，通常称为检测抗体，包被抗体和检测抗体将抗原夹在中间所以叫双抗夹心。检测抗体通常带有HRP酶标记，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，样本中抗原量越多则显色越深。现在很多ELISA试剂盒生产厂家比如：优尔生和百特纯大分子Meretciel将生物素-亲和素放大系统引入双抗夹心法，也就是在检测抗体上标记生物素，然后加入HRP酶标记的亲和素（或链亲和素），利用亲和素可以和生物素分子紧密结合的特性，将HRP酶连接到检抗上，接着加入底物显色。也有引入二抗的，如下图，检测抗体不标记，再加入HRP标记的二抗与检测抗体结合
下图为ELISA原理图，夹心法即Sandwich ELISA，竞争法就是Competitive ELISA
向左转|向右转

各位大侠，我做了两次棋盘滴定：
第一次：包被抗体浓度为：8ug/ml,4,2,1,0.5,0.25,0为A,B,C,D,E,F,G
血清稀释度为1:100
酶标抗体稀释度为：1:1000,1:5000,1:10000,1:25000为1,2，3,4
结果为：1234
A3.3440.7120.4900.238
B2.7570.5230.3450.176
C2.4280.4550.3100.172
D>4.51.7771.2150.439
E>4.51.3570.7890.424
F1.1090.2540.1720.110
G1.3660.3310.1970.069(空白)从结果可以判断包被抗体浓度1ug/ml最合适

第二次：包被抗体1ug/ml
血清稀释度为1:25,1:50,1:100,1:150,1:200,1:250,1:300,空白为A,B,C,D,E,F,G,H
酶标抗体稀释度为：1:1000,1:5000,1:10000,1:25000为1,2，3,4
结果为：1234
A2.9930.6390.3380.236
B3.0210.7220.3070.191
C2.3360.4960.3080.176
D2.2560.4640.3040.176
E2.0310.4160.2470.139
F1.8300.3360.2310.153
G1.5980.3320.2270.132
空白H0.1580.0780.0720.074
这样的话应该是血清稀释度1:50最合适，酶标抗体稀释度1:1000最合适，但是这样的话OD值为3.021，是不是太大了？OD值是不是在1左右比较好呢？应该选择哪个浓度，哪个稀释度来做正式试验呢？

冲洗不净，残留的酶结合物会分解底物显色，引起本底太高而出现错误

ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法.用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 1.双抗体夹心法测抗原　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下： 1） 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2） 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3） 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4） 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标. 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3.间接法测抗体　　间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法.操作步骤如下： 1）将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质. 2）加稀释的受检血清,保温反应.血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物.经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去. 3）加酶标抗抗体.可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体.固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶.洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关. 4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断.间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法. 间接法成功的关键在于抗原的纯度.虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性.特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应.抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应.另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果. 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性.病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分.IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面.因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封闭（blocking）固相上的空余间隙.另外,在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）,以避免过高的阴性本底影响结果的判断. 4.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc 　　ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法. 5.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素、药物等ELISA测定多用此法. 6.捕获包被法测抗体 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中.间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体.如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上.因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰.在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法.先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）.然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合.继而加酶标记针对抗原的特异性抗体.再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关.此法常用于病毒性感染的早期诊断.甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式. 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应.因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功. 7.ABS-ELISA法 ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语.亲和素是一种糖蛋白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成.生物素为小分子化合物,分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便.生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定.由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型.两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）.在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度.在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高.从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势.由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多.

方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：
　　1.　包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
　　方法二：用于检测未知抗体的间接法：
　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

该法由种类和变化可分为以下几种：
（一）双抗体夹心法
（二）间接法
（三）竞争法
（四）双位点一步法
（五）捕获法测IgM抗体
（六）应用亲和素和生物素的ELISA

?优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点（珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，须严格遵照规程操作）。　　标本的采取和保存　　通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。　　血清　　血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。　　用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000×g离心20min，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。　　采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。　　血浆　　用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。　　常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。　　细胞培养上清　　取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。　　细胞裂解液　　1) 吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。　　2) 收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。　　3) 加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。　　4) 将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。　　5) 4℃10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。　　组织匀浆液　　1) 将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。　　2) 将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分。　　3) 将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量：PBS体积=1:9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）。　　4) 吸取匀浆液到离心管，4℃5000×g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。　　尿液、唾液等其他液体生物样本　　1000×g离心20min，取上清即可检测。　　总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。　　为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本最好在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。　　另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。　　试剂的准备　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液、洗涤液应用pH计测量。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用，一般室温平衡不低于30min。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。　　加样　　在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。　　加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样（一般不建议使用）。有些指标检测（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1min。加酶结合物工作液和底物工作液时可用多道移液器，使加液过程在最短时间内完成。　　保温　　在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。　　ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。　　温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。　　保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。为避免酶标板底部受水汽或磨损导致的读数误差，一般采用鼓风恒温箱保温，这个过程必须在酶标板上方贴封纸，以免蒸发。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证时间精确，一个人一次不宜多于两块板同时操作、测定。　　洗涤　　洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。　　洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：　　（1）浸泡式：a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2min，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。　　微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。　　（2）流水冲洗式：流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2min后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2min，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳（此方法试剂盒较少采用）。　　显色和比色　　显色　　显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。　　OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30min后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。　　TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40min显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。　　比色　　比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，但应尽量避免刮花表面，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。　　比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。　　比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。　　酶标比色仪　　酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.0 01，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083± 0.01(1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。　　酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30min，测读结果更稳定（也有一些酶标仪说明书上明确标明不需要预热）。　　测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W 2，最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。　　各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。　　结果判断　　定性测定　　定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。　　在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。　　（1）间接法和夹心法　　这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。　　目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。　　a．阳性判定值　　阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。　　用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng /ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数（NC X ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：　　阳性判定值=NCX+0.05　　标本A值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。　　根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。　　b.标本/阴性对照比值　　在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive)，而是病人（patient）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05<>（或其他数值），则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。　　（2）竞争法　　在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。　　竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。　　a. 阳性判定值法　　与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±1 00u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NC X ）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX；如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：　　阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX　　标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。　　b. 抑制率法　　抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：　　抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值　　一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。　　定量测定　　ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中间较呈直线的部分是最理想的检测区域。　　测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。

这是我做双抗体夹心ELISA时设计的方案，你可以参考一下。棋盘滴定法选择抗体的最适工作浓度a)用包被缓冲液稀释单克隆抗体，浓度分别为10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml,包被酶标板，每一浓度包被三个纵行，每孔100ul，每孔均作复孔。4℃过夜，PBST洗涤3次；b)5%脱脂奶粉封闭酶标板，37℃孵育1h，洗涤3次；c)在横行包被孔中依次加入空白对照，阴性对照血清，弱阳性抗原液及强阳性抗原液，各100ul,37℃孵育1h，洗涤3次；d)在每一包被浓度的一个纵行中分别加入按1:2000、1：5000、1：10000稀释的多抗，37℃孵育1h，洗涤3次；e)在每一包被浓度的一个纵行中分别加入HRP标记IgG抗体，稀释度先按说明书上的，37℃孵育1h，洗涤3次；f)加TMB底物，37℃避光显色10-15min，用2mol/LH2SO4终止反应，酶标仪450nm读取吸光度（OD）值；g)测得的强阳性抗原液OD值在1.0左右，阴性对照OD值小于0.1的组合为较理想的组合。可根据初步确定的浓度缩小间距,再做进一步棋盘滴定,寻找最佳包被条件。抗体做稀释时最好用同一个原始浓度做倍比稀释，这样可以尽量减少由于加样枪造成的误差及人为误差。

手头有P蛋白的鼠单抗和兔多抗，现在想检测培养的肿瘤细胞中P蛋白的含量，用竞争法太浪费抗原了，想用下面的方法（类似夹心法）：
包被单抗（过量）——抗原37度1小时——多抗37度1小时——二抗——显色

按道理应该可行，但有一个问题：兔二抗对鼠一抗也会反应吗？