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ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法.用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 1.双抗体夹心法测抗原　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下： 1） 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2） 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3） 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4） 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标. 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3.间接法测抗体　　间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法.操作步骤如下： 1）将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质. 2）加稀释的受检血清,保温反应.血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物.经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去. 3）加酶标抗抗体.可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体.固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶.洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关. 4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断.间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法. 间接法成功的关键在于抗原的纯度.虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性.特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应.抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应.另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果. 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性.病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分.IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面.因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封闭（blocking）固相上的空余间隙.另外,在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）,以避免过高的阴性本底影响结果的判断. 4.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc 　　ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法. 5.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素、药物等ELISA测定多用此法. 6.捕获包被法测抗体 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中.间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体.如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上.因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰.在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法.先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）.然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合.继而加酶标记针对抗原的特异性抗体.再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关.此法常用于病毒性感染的早期诊断.甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式. 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应.因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功. 7.ABS-ELISA法 ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语.亲和素是一种糖蛋白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成.生物素为小分子化合物,分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便.生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定.由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型.两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）.在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度.在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高.从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势.由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多.

各位大侠，我做了两次棋盘滴定：
第一次：包被抗体浓度为：8ug/ml,4,2,1,0.5,0.25,0为A,B,C,D,E,F,G
血清稀释度为1:100
酶标抗体稀释度为：1:1000,1:5000,1:10000,1:25000为1,2，3,4
结果为：1234
A3.3440.7120.4900.238
B2.7570.5230.3450.176
C2.4280.4550.3100.172
D>4.51.7771.2150.439
E>4.51.3570.7890.424
F1.1090.2540.1720.110
G1.3660.3310.1970.069(空白)从结果可以判断包被抗体浓度1ug/ml最合适

第二次：包被抗体1ug/ml
血清稀释度为1:25,1:50,1:100,1:150,1:200,1:250,1:300,空白为A,B,C,D,E,F,G,H
酶标抗体稀释度为：1:1000,1:5000,1:10000,1:25000为1,2，3,4
结果为：1234
A2.9930.6390.3380.236
B3.0210.7220.3070.191
C2.3360.4960.3080.176
D2.2560.4640.3040.176
E2.0310.4160.2470.139
F1.8300.3360.2310.153
G1.5980.3320.2270.132
空白H0.1580.0780.0720.074
这样的话应该是血清稀释度1:50最合适，酶标抗体稀释度1:1000最合适，但是这样的话OD值为3.021，是不是太大了？OD值是不是在1左右比较好呢？应该选择哪个浓度，哪个稀释度来做正式试验呢？

ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
有以下几种类型：2.2.1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合
物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相
载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标
抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标
抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应
后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现
象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用
高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗
体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用
F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体
夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小
分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应
的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗
体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程
中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，
固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过
E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反
应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体
上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质
（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检
测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。2.2.4 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特
异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被
法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本
和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的
抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法
进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的
IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的
干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕
获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入
抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
（HAV）抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和
IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子
量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量
244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，
其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲
和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系
统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶
标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性
糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

我做的是血清中IKZF3测定，由于没有现成的试剂盒，自己从国内的CUSBIO定制的，分批订货。。前两次的标准曲线形状和公司提供的基本近似。但这一次却差太远。我做出来的近似线性，而公司提供的还是和原来的......

ELISA双抗体夹心法测afp的目的和原理?

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。

1、包被物和二抗的浓度需要在试试
2、封闭液肯定不好
3、显色时用封口膜盖好

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为：将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅。百特纯大分子Meretciel的测激素的ELISA试剂盒有些就是竞争法的。夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。以双抗体夹心法为主，下面以双抗体夹心法为例讲解原理（双抗原夹心法类似）：首先将具有专一性之抗体包被（coating）于酶标板上，检测时加入待测样本，样本中若含有待测抗原，则会与酶标板上包被的抗体专一性结合，然后加入另一种针对待检抗原的抗体，通常称为检测抗体，包被抗体和检测抗体将抗原夹在中间所以叫双抗夹心。检测抗体通常带有HRP酶标记，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，样本中抗原量越多则显色越深。现在很多ELISA试剂盒生产厂家比如：优尔生和百特纯大分子Meretciel将生物素-亲和素放大系统引入双抗夹心法，也就是在检测抗体上标记生物素，然后加入HRP酶标记的亲和素（或链亲和素），利用亲和素可以和生物素分子紧密结合的特性，将HRP酶连接到检抗上，接着加入底物显色。也有引入二抗的，如下图，检测抗体不标记，再加入HRP标记的二抗与检测抗体结合
下图为ELISA原理图，夹心法即Sandwich ELISA，竞争法就是Competitive ELISA
向左转|向右转

看论坛里说四参数什么的？左边两列下面六个孔全是放标准品，求大神指教，这个应该用什么曲线？做曲线时要减去空白孔吗？是要把这两列求平均值吗？做出来的样本OD值有一部分小于空白孔，应该怎么办？在论坛里看了好多贴子，说法不一，不知道应该怎么做？**！

0.2277520.2089240

0.2100740.2161990

0.2185240.2100623.9

0.2139310.2166257.8

0.2190630.22049415.6

0.252340.25620631.25

0.2834560.28338162.5

0.3451680.360872125

OD值OD值标准品浓度

手头有P蛋白的鼠单抗和兔多抗，现在想检测培养的肿瘤细胞中P蛋白的含量，用竞争法太浪费抗原了，想用下面的方法（类似夹心法）：
包被单抗（过量）——抗原37度1小时——多抗37度1小时——二抗——显色

按道理应该可行，但有一个问题：兔二抗对鼠一抗也会反应吗？

1.加大生物素标记的多抗的用量；
2.加大辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

双抗夹心法ELISA测抗原，曲线拟合时是否一定采用四参数?