 | CatalogNo.: B-0101 MW: 381.7 Purity: 99% CAS: 902779-59-3 Description: FPA-124isacell-permeableinhibitorofAkt(IC50=100nM),bindingtothePHandkinasedomains.ItinhibitscellproliferationinColo357,BxPC3,BT20,andPC3cancercelllineswithIC50valuesrangingfrom7-55nM.FPA-124inhibitedtumorgrowthinmicewithnegligIBLetoxicity. | ||
SolubilityDMSO:5mg/mLStorageStoredrybetween2-8oC.Stocksolutionsshouldbestoredfrozen(-20oC).References1)V.Barve,etal.“Synthesis,MolecularCharacterization,andBIOLOGicalActivityofNovelSyntheticDerivativesofChromen-4-oneinHumanCancerCells”J.Med.Chem.,2006,49,3800-3808. 2)Biscetti,F.,G.Straface,etal.(2009)."PioglitazoneenhancescollateralbloodflowinischemichindlimbofdiabeticmicethroughanAkt-dependentVEGF-mediatedmechanism,regardlessofPPARgammastimulation."CardiovascDiabetol8:49. 3)Brito,P.M.,R.l.Devillard,etal.(2009)."ResveratrolinhibitsthemTORmitogenicsignalingevokedbyoxidizedLDLinsmoothmusclecells."Atherosclerosis205(1):126. | |||
美国埃施朗（Echelon）公司在快速发展低碳经济和节约能源的大潮中，以美国埃施朗公司发明的LonWorks控制网络技术为基础的能源管理服务方案被越来越广泛的使用。在世界上有约9000万个内置埃施朗公司的智能网络芯片的终端设备被LonWorks控制网络连接在一起，由智能能源管理控制服务器通过Internet远程监视，控制，诊断和管理，如路灯、电表、执行器、传感器等等。其应用领域涉及楼宇、工厂、交通系统、家庭、公共设施，智能电网，绿色城市等。该能源管理服务方案包括150项专利，已有450多家OEM（原始设备制造商）厂商和90家特许集成商在为该方案提供产品和服务。通过Internet，无论是在办公楼里电梯门的开启和关闭，或者厂房间能源使用数据的采集，埃施朗公司的产品和服务使您在一个网络环境中管理设备。今天，LonWorks控制网络平台已成为全球控制网络技术的公认标准。我们在家庭、列车、半导体制造设备、智能楼宇、加油站、火车制动系统领域的网络系统解决方案，已经被许多世界标准组织采纳作为各自行业的标准，这包括：ISO/IEC对控制网络和楼宇管理规范的国际标准ISO/IEC14908-1,-2,-3和-4、中国控制联网标准GB/Z20177.1,.2,.3和.4、中国商业楼宇和住宅建设的国家标准GB/T20299.4-2006、AAR（美国铁路协会）、ANSI/CEA709.1,.2,.3和ANSI/CEA-852（美国国家标准协会），ASHRAE（美国暖通空调工程师协会），IEEE（电子电气工程师协会），IFSF（美国加油站标准论坛）和SEMI（半导体设备与材料协会）等。埃施朗公司在美国、英国、中国、日本、德国、法国、韩国和荷兰等地设立了办事处，在美洲、亚洲、欧洲各地都有商业伙伴，并为用户提供90多种产品。Echelon公司在NASDAQ股票交易所的交易代码是ELON。埃施朗公司中国代表处于一九九五年底成立，并于2001年初重新组建成埃施朗公司大中华区北京办事处至今，并设立多家代理更好地为广大中国用户提供产品和服务。其间，我们相继成立LonSupport大中华区技术支持中心、大中华区上海联络处、大中华区广州联络处。已经有超过百家中国厂商加入了LonWorks控制网络的OEM行列，从事开发新产品，承接公用事业、工业自动化、楼宇、小区智能化和运输等行业的项目。埃施朗公司将为中国的绿色，低碳，节能，环保的发展进入世界先进水平继续不懈地努力。
EchelonBiosciences成立于1997年10月3日，总部坐落于在美国犹他州。从1997到2004，EBI主要用于政府的补助金以及产品的销售收入来资助其研究工作。2005年初，EBI的依特钠Zentaris购买（NAS：AEZS）的MEP抗感染，PI3激酶小分子程序，目录业务，与科学专业。2007年末，前沿科学公司（FSI）在洛根，犹他州购买了EBI，专业从事卟啉和硼化学。自公司成立以来以来，EBI保留了开发研究试剂脂质新的检测方法。不断开拓**，从而推动药物研究的新发型。
EchelonBiosciences是美国杰出免疫学产品供应商，专业提供各种抗体、分析检测试剂盒、抑制剂等产品，尤其擅长以细胞信号、脂类代谢和标记物研究为主的相关产品。为研究治疗诸如癌症、糖尿病、炎症、感染和心脑血管疾病专家提供**有效工具。
EchelonBiosciences为生命科学社区提供的产品包括：
抗体 分析检测试剂盒
抑制剂 细胞信号产品
脂类代谢 标记物
一笔230万美元的国防部赠款将帮助神经科学家为急诊室和战场开发新的治疗方法。这项研究将集中于开发新的疗法，以帮助保护大脑和其他在创伤、心脏病发作或中风后处于危险中的器官。 罗彻斯特大学医学中心的神经学家MarcHalterman,M.D.,Ph.D该研究的首席研究员说:“虽然我们在中风或心脏骤停后恢复血液流动的能力方面取得了重大进展，但医学界并没有药物来防止这些事件发生后的继发性损害。“这项资助将进一步推进我们对一类既具有抗炎作用又具有细胞保护作用的药物的研究，我们相信这类药物将适用于军事和紧急情况。”该项目是与盐湖城的一个合成抗生素化学家团队合作开发的，该团队由MarkNelson,Ph.D领导，他将担任EchelonBiosciences的副研究员。
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LKT LabsX品牌 历史介绍:苏州蚂蚁淘生物科技有限公司，作为一家生命科学领域的高科技生物公司，目前代理销售二十多家欧美著名生物技术公司的产品，覆盖了免疫学、细胞生物学、分子生物学、药物筛选、生物制药、食品检测、疫苗生产等领域。
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MBL-DNA损伤/细胞增殖ELISA试剂盒
CycLex细胞BrdU ELISA试剂盒是一种非同位素免疫测定法，用于在DNA合成过程中半定量测量新合成的DNA中BrdU（溴脱氧尿苷）的掺入量。
开发了一种快速方便的估计群体中S期细胞的方法，该方法可通过细胞ELISA形式的单克隆抗BrdU抗体检测掺入DNA中的溴脱氧尿苷（BrdU）。已经表明可以通过测量新合成的细胞DNA中BrdU掺入量来进行细胞增殖的精确评估。此外，细胞BrdU ELISA与[3H]-胸苷掺入分析之间存在良好的相关性，适用于多种鼠类和人类细胞系统，包括促分裂原和抗原刺激的淋巴细胞以及细胞因子诱导的不同细胞增殖线。
MabtechX品牌 历史介绍:苏州蚂蚁淘生物科技有限公司，作为一家生命科学领域的高科技生物公司，目前代理销售二十多家欧美著名生物技术公司的产品，覆盖了免疫学、细胞生物学、分子生物学、药物筛选、生物制药、食品检测、疫苗生产等领域。
白蛋白血浆含量、、溶解度、功能较种蛋白质水肿
（2）血浆血白蛋白运输功能
血浆白蛋白能与体内许难溶性机物机离逆结合形易溶性复合物些物质血液循环运输形式由见白蛋白属于非专性运输蛋白理具重要性与体健康密切相关血白蛋白适用于低蛋白血症防治治疗肝硬化及肾病引起水肿或腹水
（3）血浆白蛋白其理作用
血浆白蛋白含量远比球蛋白亲水作用比球蛋白使血浆白蛋白球蛋白起种胶体保护稳定作用肝脏功能障碍引起白蛋白合足使血浆球蛋白失胶体保护作用稳定性降血浆球蛋白稳定性降严重影响些物质体内代谢、利用引起相应症状外白蛋白体内种重要营养物质白蛋白血浆断进行着代谢更新血浆白蛋白解产氨基酸用于合组织蛋白氧化解供应能量或转变其含氮物质
具性激素或药物与白蛋白结合表现其性视其储存形式由于种结合逆性处于态平衡调节些激素药物代谢具重要意义
白蛋白具黏性、胶质性物质体内遇重金属离自与重金属离结合由排泄系统排体外起解毒作用食用含白蛋白丰富食物避免重金属离吸收毒白蛋白胃壁保护作用
血白蛋白血液制品种俗称命制品、救命药健康血液提炼加工直接静脉注射病体内其主要功能增强免疫力抵抗力市场价300400元瓶临床主要用于失血创伤烧伤等引起休克、脑水肿及肝硬化、肾病引起水肿或腹水等危重病症治疗及低蛋白血症病
参考：1、白蛋白纯化；2、白蛋白纯化；3、白蛋白抗体亲产工艺；4、包括加热处理步骤血清白蛋白制造；5、沉淀物血制取蛋白 肝功能检查检查白蛋白作用根据白蛋白检查结判断某些疾病同龄段白蛋白值相同新白蛋白值范围28～44g/L14岁白蛋白值范围38～54g/L白蛋白值范围35～50g/L60岁白蛋白值范围34～48g/L般情况白蛋白增高主要见于血液浓缩致相性增高严重脱水休克、严重烧伤、烫伤、急性血、慢性肾腺皮质功能减低症白蛋白降低见于肝硬化合并腹水及其肝功能严重损害(急性肝坏死、毒性肝炎等)营养良、慢性消耗性疾病、糖尿病、严重血肾病综合征等白蛋白降低至25g/L易产腹水
1:血白蛋白理基础:
血清白蛋白（HSA）由肝脏合含量丰富功能非糖基化血浆蛋白具备种理功能白蛋白通占血浆蛋白质总含量50%浓度约0.6mmol/LHSA球形蛋白质由585种氨基酸组 (66-69kd)许带电残基（例赖氨酸、冬氨酸没辅基基团或者碳水化合物）少量色氨酸或者甲硫丁氨酸残基X线衍射晶体析显示白蛋白形三级结构HSA溶液椭圆体约67%HSA三级结构由α螺旋组实际蛋白由3应结构域组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)每含两亚级结构域（AB）每亚级结构域由6α螺旋组两亚级结构通脯氨酸残基提供灵环结构作相移助于结合物质结构域间二硫键连接灵HSA包含35半胱氨酸残基其部形二硫键（共17）构整三级结构（图1）
图1. 白蛋白三级空间结构
2:血白蛋白化特性治疗潜力
白蛋白体理产物其独特三级空间结构使白蛋白拥化特性临床带更获益
a:维持胶体渗透压:
血白蛋白作种胶体效维持着血浆胶体渗透压体血浆白蛋白含量约35－50g/l,约占血浆总蛋白含量60%血浆80%胶体渗透压源自白蛋白产5%白蛋白（百特商品名：Buminate5%/250ml）胶体渗透压着与体相似胶体渗透压等渗白蛋白输入削减组织间液；20%25%白蛋白高渗白蛋白显著削减组织间液
b:物质结合转运：
HAS能结合许内源性外源性化合物与药物、营养物质给予疗效、解毒抗氧化作用密切相关HSA所能结合物质：药物（抗素、止痛药、抗凝药、抗癫痫药、免疫抑制剂等）、脂肪酸、维素D3、氨基酸、酶、胆红素、激素、金属（铜）、氧化氮、花四稀酸代谢物等纠低蛋白血症使临床获益能白蛋白功能关
c:协调血管内皮完整性
Dubniks等鼠试验发现微血管通透性增加情况5%白蛋白着比工胶体更扩容效认白蛋白能血管内壁构完整血管内皮表层血管内皮表层阻止液体外渗重要结构物质
d:保护血细胞调节凝血
白蛋白体血液组部所白蛋白着血细胞保护调节凝血功能肺旁路手术使用白蛋白作预充液组部患者围术期失血显著低于工胶体每100ml肺旁路术预充液添加少于0.0375g白蛋白保护血细胞血板功能Blanloeil等顾析1954-2000与血液稀释相关文献发现输注白蛋白要血液稀释比例超50%凝血削弱作用
e:激炎症反应
证据表明白蛋白巯基基团能基于氧化原状态发炎症细胞调节变化信号Alam等猪休克模型采用同液体进行复苏发现使用白蛋白全血组复苏体内性粒细胞数量与休克前相比并没显著变化其组均现比较明显性粒细胞数增加所使用白蛋白进行液体复苏并激炎症反应减少炎性物质白介素干扰素量释放体造进步伤害
f:器官保护
基于白蛋白引起全身炎症反应所使用白蛋白已经显示休克复苏调节性粒细胞内皮细胞相互作用减轻肺损伤Martin等发现于急性肺损伤患者使用速尿联合白蛋白比仅使用速尿患者24氧合指数脏指数都显著改善白蛋白给药能改善低白蛋白血症重症患者器官功能呼吸、血管枢神经系统白蛋白联合抗素减少肝硬化合并自发性细菌腹膜炎患者肾损坏死亡发率使用MARS（吸附循环系统使用含白蛋白透析液）治疗4,000位患肝机能异或衰竭患者程表明白蛋白提高肾功能血液力疗效并减少脑水肿肝性脑病发
g:其：抗氧化损伤修复等
亚铁血红素认拥通铁氧化原反应特性获促氧化剂特性HSA十效亚铁血红素结合蛋白旦结合白蛋白促氧化剂特性减弱显示抗氧化剂功能于损伤修复能提供氮源进行损伤修复观点受质疑合蛋白质单位氨基酸白蛋白输注需要解氨基酸再合组织修复相应蛋白质程显且经济直接输注氨基酸直接何解释临床观察白蛋白于术伤口愈合带益处者发现白蛋白于修复组织帮助能通加速新陈代谢达
3：白蛋白液体复苏
a:白蛋白作复苏液增加危重症患者死亡率：SAFE 研究vs. Cochrane荟萃析
白蛋白作液体复苏液使用源自20世纪40代二战挽救数命1998Corchrane荟萃析（24研究1419病例）显示使用白蛋白与使用晶体液相比使危重症病死亡风险增加6%.该文章发表引起巨波澜FDA结论发使用白蛋白警告全球白蛋白处量明显减少随达22篇文章发表致反Cochrane研究结论其Wilkes等更随机照研究（55研究3504病例）进行荟萃析显示采用白蛋白进行液体复苏并增加患者死亡率直至2004程碑式SAFE（Saline versus Albumin Fluid Evaluation）研究结发表明确作危重症患者复苏液白蛋白安全增加死亡率结论美FDA撤销白蛋白警告白蛋白处量恢复1998前水平SAFE研究项随即照研究入选病例达6997例研究主要目研究名称,证实白蛋白安全性首要终点重症患者比较等渗白蛋白与理盐水进行液体复苏28治疗期内死亡率该研究设计并未入组患者白蛋白水平设限两组病基线白蛋白水平均值27g/l白蛋白纠低蛋白血症所带能获益该研究体现SAFE亚组析发现于脓毒症患者使用白蛋白更存率于脑外伤病发现使用白蛋白增加死亡率文章认由于该亚组本量少差异能由于机误差产另外脑外伤6月才评价死亡率合适间随文章认白蛋白增加脑外伤患者死亡率结信使用白蛋白整体器官功能28死亡率并没增加
b:白蛋白作液体复苏液理由
l 白蛋白理功能纠低蛋白血症所液体复苏患者同伴低蛋白血症使用白蛋白进行液体复苏举两做
l 白蛋白器官保护作用病休克间越久越能诱发肾功能损害所使用白蛋白进行液体复苏更保护肾脏等诸脏器
l 凝血保护于剂量液体复苏凝血风险避问题使用白蛋白减少凝血功能遭破坏风险
l 白蛋白扩容效白蛋白能参与构完整血管内皮表层所鼠试验观察结论血管通透性增加5%白蛋白3内扩容效都要优于明胶羟乙基淀粉
l 白蛋白半衰期较健康青男性群作放射标记白蛋白解代谢研究结表明半衰期12.7-18.2（平均14.8）特点使白蛋白血管内维持更久另外白蛋白渗漏至组织间液通淋巴管重新血管内造组织间蓄积
c:5%等渗血白蛋白高渗血白蛋白
内市售血白蛋白制剂4%、5%、10%、20%25%几种浓度其5%20%主流产品两种白蛋白由于渗透压同带临床使用差异5%白蛋白等渗血白蛋白引起组织间液向血管内转移5%/250ml等渗白蛋白输入其血浆扩容量约250－500ml间；20%高渗白蛋白显著削弱组织间液更适合水肿病20%/50ml高渗白蛋白输注其血浆扩容量约230ml5%等渗白蛋白导致组织间液向血管内显著液体流所能更稳定体内环境于功能患者减少衰风险发美比起高渗白蛋白等渗白蛋白扩容面更受临床医师欢迎
d：情况使用应该首选血白蛋白作液体复苏液
于伴低蛋白血症液体复苏患者考虑首选血白蛋白根据病/否水肿判断使用高渗/等渗白蛋白
于伴凝血风险,肾损害风险或功能较差液体复苏患者首选5%等渗血白蛋白
4：纠低蛋白血症能降低死亡率及并发症发风险
血清白蛋白水平与危重症病预显著相关性内著名专家黎介寿发现严重染危重病白蛋白水平于35g/l死亡率0；白蛋白水平于20g/l死亡率高达54%
项型荟萃析包括90析低蛋白血症预预测性队列研究 (n=291,433) 9研究纠低蛋白血症治疗前瞻性照试验 (n=535)发现低蛋白血症患者白蛋白水平每降低10g/l其死亡率增加137%并发症发率增加89%ICU停留间延28%住院间延71%治疗费用增加66%文章认低白蛋白血症增加危重患者死亡率并发症独立危险素给予外源性白蛋白需达血浆白蛋白浓度达30g/L显著减少并发症发率79项随机试验荟萃析使用白蛋白与使用晶体、工胶体、使用白蛋白或剂量白蛋白比较随机照试验共4755例患者其59项（占79项74.7%）试验治疗结显著性差异认使用白蛋白带临床获益发现低白蛋白血症患者剂量白蛋白减少死亡率说明同临床领域使用白蛋白带临床获益所于低蛋白血症患者要临床觉使用必要应该限制使用
5：白蛋白产品安全性
白蛋白体产物所其产良反应较各种工胶体低参考白蛋白其胶体液用于扩容安全性比较（表2）白蛋白急性反应事件威胁命严重良事件均少
表2.白蛋白其胶体液用于扩容安全性比较
10家全球主要白蛋白供应商1998-2000总共向市场供应648000000克白蛋白共收198非致命性良事件13致命性良事件报道若40克处剂量析显示：每1000000处非致命性良反应发率4.65,致命性良反应发率0.185结论显示：血白蛋白具非安全记录
6：使用白蛋白经济性
白蛋白减少并发症发率同缩短ICU停留间住院间保护凝血功能等所整疗程价格反更加经济项美研究统计5156名脓毒症患者发现使用白蛋白每命节约6037欧元每每节约617欧元美较医院数据库院数据进行顾性析19,578冠脉搭桥术患者操作应用胶体使用白蛋白组死亡率2.47%,低于非蛋白胶体组3.03%应用白蛋白每命节省52,000-54,000美元图" class="ikqb_img_alink">
对在动物体内发生免疫反响而言，大多数多肽的分子量都太小。将多肽与载体蛋白如KLH等交联以后，不仅能添加抗原的巨细，也能增强免疫性。咱们能够提供与KLH和BSA两种蛋白的交联。大多数客户挑选与KLH交联，由于KLH的免疫性非常好，而且BSA在许多试验中作为Blocking试剂，由于动物体内既会发生对多肽的抗体也会发生对载体蛋白的抗体，这么会呈现假阳性。
二、抗体的运用
由于抗体与许多生物分子，以蛋白和多肽等尤为明显，有很强的联系才能，抗体在生物医学研讨中占据共同的主要位置，在对蛋白的特性、含量的测定、散布状况的分析和蛋白的确证等方面都需要用到抗体。例如：确诊试剂盒如早孕试剂盒等，蛋白microalloy、immunohistochemistry 和普通的ELISA试验等。由于抗体有对特定分子很强的联系才能的特点，用抗体进行体内医治成了许多尽力的方向。成功的典范包含Genetech的Herceptin,用于医治一类特殊的乳腺癌和IDEC药业公司的Ritaxan，用于特定类型的Non-Hodgkin`s Lymphomas B-细胞。
三、抗原和辨认区域
大多数状况下，antigen和immunogen两个字是能够交换运用的，它们的差别是很小的。他们是别离指一个分子与免疫系统之间的两种类型的相互作用。一个immunogen是指能使一个生物组织的免疫系统发生免疫反响的分子，而一个antigen是指能与这种免疫反响的产品联系的分子，所以immunogen一定是antigen，但antigen纷歧定是immunogen，咱们这儿通用antigen，特指能与免疫反响的产品—抗体联系的分子。 辨认区域（epitopes）是指一个抗原分子中一个与抗体直接联系的一段特定的序列，关于任何抗原（抗原蛋白），很有可能有多个抗体辨认区域，对出产抗体而言，易于抗体辨认的部位的辨认区域最为理想。
四、进行KLH交联的化学办法
我们用MBS活化KLH，这么能将载体蛋白（KLH）上面的自在-SH与多肽末端的Cys的侧链-SH连接起来，这种办法直接，特异性高，而且安稳，一般挑选对免疫不主要的一端进行交联。 EDC活化载体上的-COOH，将载体的-COOH和多肽的-NH2连接起来也是一种可行的办法。但咱们只主张在多肽序列中有多个Cys时采用该办法。如果肽链中含有多个-COOH或-NH2基因，不主张运用该办法，由于会构成多重点交联的状况，使多肽构造受影响。常用载体蛋白除KLH外，还有BSA，Ovalbumin等，构成KLH的优势是它不搅扰ELISA或Western Blot等试验。
五、对抗原多肽交联适宜的肽链长度
一般主张10-15个残基进行交联。肽链越长，抗体辨认的区域越多，但也就越多时机构成安稳的二级构造。就不再是天然的方式了。太短的肽一般是没有用的，除非有足够的理由，如与有关宗族蛋白或别的蛋白有序列同源性等。
六、KLH交联多肽溶液呈乳状的要素
KLH是一个很大的而且聚合的蛋白。由于它的构造和巨细，它在水中的溶解度是很有限的，因而是乳状，这并不影响它的免疫性，这种混浊的溶液能够直接免疫动物。
七、抗体的产值
抗体的产值取决于许多要素：辨认区域的挑选，多肽的合成，载体的交联，免疫的操作步骤和动物的生理系统等等，因而抗体的产值是不等的。5-25mg都归于正常规模。
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一、试验原理
细胞培育可分为原代培育和传代培育。直接从体内获取的安排细胞进行初次培育为原代培育；当原代培育的细胞增殖到达必定密度后，则需求做再培育，即将培育的细胞涣散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培育，为传代培育，传代培育的累积次数即是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，试验证实这么能够最大极限的保留细胞生机。现在细胞冻存多选用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能进步细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，削减细胞内冰晶的构成，然后削减因为冰晶构成形成的细胞损害。复苏细胞应选用敏捷消融的方法，这么能够确保细胞外结晶在很短的时间内即消融，防止因为缓慢消融使水分渗入细胞内构成胞内再结晶对细胞形成损害。
二、试验办法
资料：
小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培育皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培育瓶，培育液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培育箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
办法：
（1）原代培育：
1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起肌肤，用解剖剪剪开肌肤一个横切断，将肌肤向上扯开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左边找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培育皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洁屡次，并除掉剩余无用的安排。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，悄悄在筛网上进行碾磨，一起不断滴加不含血清的培育液冲刷。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去掉血液等）。
6.参加10ml培育液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培育瓶中，悄悄摇晃混匀，在培育瓶上。
面做好象征，注明细胞、组别及日期。然后将培育瓶置于二氧化碳培育箱中培育。
（2）传代培育：
1.倒置显微镜下调查细胞形状，确定细胞是不是需求传代。
2.培育液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。
3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培育液瓶中。
4.打开培育瓶，瓶口过火，将培育瓶内的培育液悄悄倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培育基。
5.培育瓶参加0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下调查到细胞收回突起变圆时当即翻转培育瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，参加少数的含血清的新鲜培育基。
6.取弯头滴管重复吹打细胞使其脱壁并涣散，再依据分传瓶数补加必定量的含血清的新鲜培育基，制成细胞悬液，然后分装到新培育瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍反转，以利于CO2气体的进入，将培育瓶放回CO2培育箱。
7.对半贴壁培育细胞，不需胰酶，直接吹打，参加新鲜培育基，然后分装到各瓶中。
（3）冻存：
1.汲取传代后的细胞悬液，离心，去掉培育液，参加冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目通常为（5～10）×106个/ml，2ml冻存管中通常放1～1.5ml细胞）。
2.按步冻存
o冷冻保留办法一：规范的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可敏捷浸入液氮中。
o冷冻保留办法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长时间保留。
（4）复苏：
1.取出冷冻管，当即放入37℃水浴箱中敏捷冻结，轻摇冷冻管使其在1分钟内悉数消融，移入无菌操作台内。
2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
4.加恰当培育液后将细胞转移至培育瓶中，37℃培育，第二天调查成长状况。
三、试验成果核算
1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108个脾细胞。
2.细胞接种后通常几小时内就能贴壁，并开端成长，如接种的细胞密度适合，5天到一星期即可构成单层。
3.通常状况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培育瓶壁上，2～4天就可在瓶内构成单层，需求再次进行传代。
四、留意事项
1.选材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，留意不要损害脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。
2.冲刷脾脏时要尽量洗净血污，去掉无用安排，并要防止安排枯燥。
3.碾磨后及时用清水冲刷筛网，防止安排、细胞堵塞网孔。
4.计数前，留意吸尽平皿里的细胞，充沛混匀，使细胞分散成单个细胞。
5.试验操作应在操作台中心无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。
6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才干挟取安排，防止构成安排损害。
7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，防止烧焦发生有毒气体，损害培育细胞。
8.汲取过营养液后的吸管不能再用火焰炙烤，因残留在吸管头中营养液能烧焦构成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。
9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等一切可能与细胞触摸的有些，如已触摸，要用火焰炙烤消毒或取备品更换。
10.敞开、封闭长有细胞的培育瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。
11.换液时倾倒废液，瓶口不能触摸废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。
12.吹打细胞时，要留意边角的细胞是不是吹打下来。
13.手或相对较脏的物品不能通过敞开的瓶口上，即不可以在敞开容器上方操作。
14.每次操作只处理一株细胞，防止构成细胞穿插污染。
15.留意本身的安全，关于来自人源性或病毒感染的细胞株应格外当心。操作过程中，应防止引起气溶胶的发生，当心有毒性试剂例如DMSO，并防止尖利物品伤人等。
16.从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但最佳为对数成长期细胞。在冻存前一天最佳换一次培育液。
17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，防止冻伤。
18.冻存和复苏最佳用新配制的培育液。
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