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我要做载体构建的课题,想用pCDNA3.1TATOPO克隆试剂盒进行连接,不用限制酶切割即能把目的基因连入载体里,我对这个原理不太清楚,有用过的可以详细介绍一下吗?现在哪个公司做这种试剂盒?从哪里可以买得到?先谢谢大家了!

最近用无缝克隆试剂盒构建CRISPR载体完全不长菌，以前都是长菌的啊，而且成功率很高，这是怎么回事？换过别的牌子的无缝克隆试剂盒还是一样不长菌，我好崩溃啊，为什么会这样呢。一样的方法做的，比例也是按说明书上来的，为什么会不长菌呢。求高手指点。

最近用stratagene点突变试剂盒quickchangesitedirectedmutagenesiskit作定点突变，完全是按照公司提供的protocol做的，模版经电泳和测序也没有问题，但最终突变后质粒转染细菌老是长不出克隆，可能是什么问题？作哪些调整？求教了

想做EV71的CDNA感染性克隆，在引物的5‘端引入启动子序列，然后利用用T7启动子进行体外转录，转染细胞，拯救活病毒，现在有几个问题不太明白，想请教一下各位：

1.如果在引物的5’引物引入了T7启动子，3‘引物也引入了polyT,PCR扩增出全长片段，回收纯化之后可以用来直接做体外转录么？为什么看到文献里都是先把这个PCR片段连接到载体里面，扩增之后提取出来线性化之后，再进行体外转录。是不是转录对模板的量有要求？

2.如果使用一些带有T7启动子序列的载体比如pBluescriptSK，在启动子序列和酶切位点之间还有多余的一段序列，这段序列也会被启动子转录，这一小段多余的序列是否会对接下来的转染以及病毒拯救带来影响？

3.有人在做反向遗传么，哪些载体可以用来进行体外转录？插入片段为7.5K。

采用6孔板接毒后，铺上低溶解度琼脂糖，第二天就出来了这些病变，正常细胞没有出现这种现象。
按说空斑应该出现多个，但我的六孔板中一个空最多也就出现了2个空斑，也不像文献报道的那样规则，而且很大！
由于没有做梯度稀释，会不会是接毒量过大造成的啊？请大侠指点，万分感谢！

启没cDNA文库,genomic DNA,用DNA模板才能扩

白细胞介素10（IL-10）是一种由多种细胞亚群产生的重要免疫调节因子。

早期研究显示，其主要生物功能为限制炎症反应及调节多种免疫细胞的分化和增殖，例如：T细胞、B细胞、NK细胞、

抗原呈递细胞、肥大细胞、粒细胞等。近来研究结果提示，IL-10也可以介导免疫反应的激活，有助于清除感染及非感染

颗粒且只产生轻微的炎症反应。大量的研究，包括患者IL-10的表达分析、体外实验及动物实验表明，IL-10与自身免疫

性疾病、炎症、肿瘤等疾病的发生、发展关系密切。临床试验主要集中于RA、炎症性肠病、银屑病、器官移植和丙型肝

炎等。虽然试验结果各不相同，但是使我们对IL-10在免疫反应中的作用的认识更加深入，同时也预示IL-10可以成为一

种治疗药物。目前，我国还没有重组基因工程IL-10药物上市，而且在探索如何高效表达具有生物活性rhIL-10的研究尚

处于起步阶段。本研究建立在国内外IL-10重组基因工程研究基础上，拟克隆人IL-10基因，通过原核、真核两种表达系

统表达IL-10蛋白，奠定重组基因工程研制人IL-10的基础。主要研究结果如下：一、依据Genbank中人类IL-10序列设计

一对特异性引物，应用RT-PCR技术，从LPS刺激的外周血单个核细胞中成功地克隆出hIL-10成熟肽编码序列，并将之克

隆入pGEM-T载体，构建出中间载体<WP=91>pGEM-T-hIL-10，转化入大肠杆菌JM109中，经酶切鉴定及序列测定与

分析，与GenBank中发表的（NM000572.2）hIL-10成熟肽编码序列完全一致。为hIL-10基因的表达研究奠定了基

础。二、从中间载体pGEM-T-hIL-10中将hIL-10成熟肽编码序列酶切回收，定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)的T7

启动子下游，成功地构建了原核表达载体pET-28a(+)-hIL-10，将表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLyss中获得表达

菌株，经IPTG的诱导获得较高表达，表达蛋白以包涵体形式存在。经薄层扫描确定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的

28.7%。Westernblotting分析结果显示，表达产物与抗hIL-10单克隆抗体呈特异性阳性反应。产物经固相金属离子亲

和层析方法初步纯化，并在柱上应用浓度递减的尿素缓冲液对产物进行复性。活性研究结果表明，复性产物具有抑制

LPS刺激的外周血单核细胞表达MHCⅡ分子的活性。三、为了进一步获得高活性、高表达、适用于产业化生产的rhIL-

10，本研究选择应用酵母表达系统对hIL-10进行表达。应用PCR方法从pGEM-T-hIL-10扩增出hIL-10成熟肽编码序

列，并在其上下游分别引入EcoRI和BaxⅠ两个酶切位点，通过定向克隆成功地构建出分泌型酵母表达载体pPICZαA-

rhIL-10。采用电穿孔技术将表达单位转化入酵母菌P.pastorisX-33中，通过提取酵母基因组进行PCR鉴定以及

MD/MM营养表型筛选，初步筛选出10株可表达具有hIL-10活性的酵母菌。小量发酵培养表达菌株，以0.5%甲醇诱导

96小时，培养上清中蛋白经硫酸铵沉淀后，经SDS-PAGE、薄层扫描显示rhIL-10约占样品蛋白总量的10%。产物经固

相金属离子亲和层析方法初步纯化，纯度达94%。活性研究结果显示酵母表达的分泌型rhIL-10具有较原核表达产物更高

的活性。

楼主
兔抗nf-κp65克隆抗体试剂
价格1元每盒
知道真
希望帮、

我近期想开展此方面课题，急需抗体，请老师们指教，多谢！

克隆世界先进技术否认克隆能给我带处我觉克隆能带给我处并朝觉自否自自否别取替否相信自身边类技术福祸线差
　　我认克隆程度促进类科技文化发展同我应该看克隆仍存许弊端克隆能类作贡献能效繁殖高附加值牲畜挽救珍稀物研究癌物研究免疫研究寿命低估作用类欲望并容易满足克隆物功类自想克隆目前看克隆并利于类发展相反克隆所引起诸基变种等问题都应该引起类重视

　　想要克隆克隆研制没潜未比说克隆否健全安全远看给我整类物种安全没危害我现清楚克隆理意义全部健全社意义健全没传统意义父亲没传统意义母亲异类异类社相处候给理反环境点
　　类独二事情拼搏克隆世界独二

　　要良份总统克隆真杀乱克隆类克隆认识够充足所损益东西复制要考虑问题比：原体办克隆品所看待位……

　　我同意克隆发展讨论位克隆能否诞或残品刻我暂让问题与科脱钩面情与伦理我姑且判定克隆与异或何度自平凡
　　或父母谁或父母呢谁抚养呢谁谁投注真诚情克隆命比球任何命都要值钱所科家都竭尽全力挽救命理家任何情绪异趋若鹜至于恐惧孤独注定能享谁嫁哪异性发自内整摆布实验品肯定些借机扬名作秀或者由科家做主克隆双配婚姻先具备实验性质于于克隆说情比母更没保证
　　难发现克隆作除拥掉定语称谓外切与社、伦理、情关享受都与缘

　　1． 克隆研究风险性
　　目前物体细胞克隆技术存着难预测消除技术风险已经伦理层面反克隆重要科依据 克隆存着较风险性 论科家普通公众始终都物克隆技术发展现况类比克隆研究发展前景并作进步推论逻辑基础即目前物克隆实验仍处于初始阶段克隆技术熟物克隆实验现高失败率、高风险、使用量重组卵细胞、量畸形代及发排斥现象等问题现克隆研究仅仅通某项物克隆功案判断克隆技术普遍行性错误至少严谨科家认要物（绵羊）克隆实验技术经验应用类体身并非件容易事情种熟技术硬要作用于体克隆程充满各式各危险例英胚胎家威尔莫特认理由考虑由扎沃斯安蒂诺等宣布克隆实验同高失败率试图进行物克隆并且现或者预见未没行技术检查物胚胎所基组发育状态保证植入宫内胚胎否能够发育至于畸形或使代孕母体安全受严重威胁
　　另外海召2002际类基组科院副院陈竺院士指早站反克隆培育克隆羊英科家专家清楚目前技术离克隆远……克隆羊莉功经历277克隆羊实验失败波折怪胎、畸形层穷幕克隆重演谁277条命夭折负责克隆物发现存早衰现象尚解释顾切匆忙进行克隆能酿错陈竺院士言论看物克隆情况类比未克隆情况外科家反复莉羊情况观照克隆技术发展说明领域没更经验证据说明问题实质技术风险

　　2．克隆行违背社伦理
　　于自社克隆行伦理层面指责科界能于衷受影响科家发表类似观点世界医协主席恩克•阿科尔西20018月8发表声明指克隆技术用于类自悖于类价值、伦理道德原则代表世界医协坚决反克隆实验计划〔5〕另外角度威尔莫特媒体说：试想我妻与我复制‘我’三起产极寻关系我三每尤其复制‘我’都十尴尬必须坚决反克隆
　　科家伦理家、社家家能伦理、社等层面克隆问题展系统、溯根求源式理析作现实社员克隆问题必着与其社员相似觉科界社伦理层面反克隆研究

　　3．克隆行违背科道德
　　（1）科道德与科技工作者社职责
　　道德属于种社意识定社条件调整间行规范准则总恩格斯曾经指：每阶段甚至每行业都各各道德〔7〕我知道古希波克拉底誓言（the Hippocratic Oath）作医师团体职业誓约书要求业者：应尽自知识与能力医治病越医疗行并坚守品性与道德规范科技术研究、发应用程同要求遵守定道德原则

　　2． 现代科技术社功能越越强社渗透越越广泛越能引起更社、伦理律等问题科技工作者社责任比前显更加突重要科科、科考虑效用或利益 等说已经合宜科技工作者必须应该追求何种知识、所追求知识应置于何种位及何应用些知识等系列问题做理性析判断些问题早引起科界重视19557月15包括玻恩、海森堡居夫内52位诺贝尔奖获者《迈瑙宣言》针科技术社价值反思说：我愉快贡献我切科服务我相信科通向类幸福路我怀着惊恐情看：科向类提供自杀手段
　　再克隆技术能失败科研究者公认物克隆实验看克隆物种率低利羊克隆实验277胚胎融合仅仅莉功率0.36%许幸降克隆牛快死于脏异、尿毒症或呼吸困难克隆物部体表现理或免疫缺陷血液含氧量浓度低于；胸腺、脾、淋巴腺发育等
　　现许科研究者已经始克隆类进行克隆技术种失败能性放任失败克隆伤害克隆失败怪婴诞看幕幕让寒类克隆罪证命践踏毫疑问研究犯罪任何理性支持项杀主要代价研究更怕种研究结给类带更犯罪灾难种让类走向灭亡技术进步
　　1） 克隆减少遗传变异通克隆产体具同遗传基同疾病敏性种疾病毁灭整由克隆产群体
　　克隆物遗传全等种特定病毒或其疾病染带灾难 设想家牛群都同克隆产物种并严重病毒能毁灭全畜牧业
　　2) 克隆技术使用使倾向于量繁殖现种群利用价值体按自规律促进整种群优胜劣汰意义说克隆技术干扰自进化程.
　　克隆技术导致基复制威胁基性保持物演化现逆向颠倒程即由复杂走向简单物存极利
　　3) 克隆技术种昂贵技术需要量金钱物专业士参与失败率非高莉277实验唯虽现发展更先进技术功率能达2-3%
　　失败率高达95%至98%其途夭折胚胎畸形导致短命事实世界各牛、羊、猪鼠克隆实验平均功率2%,2%解决克隆物早衰现象
　　克隆源物细胞必定带已经化基些基影响克隆物寿命呢种担已经证实论克隆羊利培育克隆物都同程度表现早衰特征说明物细胞遗传物质同殖细胞遗传物质毕竟存质量差别
　　4) 转基物提高疾病传染风险例产药物牛奶牛染病毒种病毒能通牛奶染病
　　5) 克隆技术应用于体导致代遗传性状工控制克隆技术引起争论核能否允许发育初期类胚胎进行遗传操作伦理家所能接受
　　6) 克隆技术用创造超或拥健壮体格却智力低且克隆技术能够类效运用男性失遗传意义

配置制备

量水用精细般瓶装乙醚即

经费有限，想自己作PCR产物转质粒用的TA克隆5个，请教各位DX用哪家的试剂盒好，价格又可以接受？