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:(我提取的小分子蛋白里含有很多的色素和糖类，不知道用什么方法可以除去，想首先过透析，让小分子蛋白出来，然后浓缩外液，然后DEAE除色素（不知道是否可以除去色素，看过有人这样除，但不知道原理），然后不知道小分子的低聚糖怎么除去？不知道我的思路怎样？可否指点？

对多糖类有效部位新药药学研究的建议
正文审评二部李计萍

多糖广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中，来源很广。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗生产。多糖的研究起自20世纪60年代，从20世纪70年代开始逐渐发现多糖及其复合物(蛋白多糖和脂多糖)具有多方面的药理作用，主要包括：增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器的保护作用等。
由于多糖多种多样的生物活性以及在保健、疾病治疗领域的广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。笔者在近年的中药新药审评中遇到了一些以多糖为有效部位的新药，并且发现了一些值得讨论的问题。多糖的质量控制是一个全过程的控制，现就工艺研究、质量控制研究两个方面进行讨论。
一、工艺方面：
现阶段多糖类有效部位新药的申请相对较少，作为新药工业化生产的提取纯化方法还不成熟，以下介绍的一些方法，在多糖研究中虽比较常用，但应用于新药生产中是否可行，尚需深入研究，要结合品种特点及环保等因素综合考虑。
1、提取纯化
多糖的工艺研究一般包括提取、除脂、脱色、除蛋白、醇沉、柱分离纯化、透析等基本步骤。多糖的提取及分离纯化直接影响到成品中多糖的纯度，从而影响到多糖类有效部位的质量控制，最终影响到成品的疗效。
对多糖的提取纯化方法应根据不同的动、植物来源采用不同的方法进行提取纯化。为保证多糖提取较充分，首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖及微生物细胞内多糖的组织细胞多有脂质包围，一般先加入甲醇或1∶1的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂；含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物。
在选择提取纯化方法时，应考虑所用方法对不同类别多糖及在大生产条件下的适应情况。如凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。
对于植物或动物中所含成分可能为糖肽的，应在提取纯化时注意不破坏其结构，并应通过结构分析及含量测定等方法，结合药效学试验，提供研究资料证明其有效部位为糖肽。
多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法三氯乙酸法,后者较为剧烈，对于含呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，所以不宜使用。但该法效率较高，操作简便，植物来源的多糖常采用该法。上述三种方法均不适合于糖肽，因为糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。除去蛋白质后，应再透析一次，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析，可以将不同分子大小的多糖进行分离和纯化，该法用于除去小分子物质十分实用，同时能满足大生产的需要，具有广阔的应用前景。至此，得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。
对于透析、超滤及超速离心，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。
但常用的去蛋白方法、透析、分级沉淀法等纯化方法，大生产时的可行性值得深入研究。
2、考察指标的选择
在审评中常见的问题是：仅用多糖或总糖的含量作为考察指标，无法说明提取纯化过程中多糖结构的变化、各多糖之间量的变化以及分子量分布的变化与药效的相关性。如审评的某一多糖类有效部位的新药，在提取分离、灭菌方法的研究中，以酸性多糖和中性多糖的含量、分子量分布情况、灭菌情况为指标，考察工艺过程。经研究发现：提取过程中通过乙醇分级纯化，分子量分布范围缩小。通过比较，高温及活性炭灭菌方法均对多糖含量有影响。后采用加一定浓度的酸进行灭菌，不同酸度，灭菌情况不同。在酸性条件下灭菌时，多糖发生了降解，分子量范围变小。当分子量降到一定范围时药效降低，虽然在整个过程中总多糖含量没有变化，但由于分子量分布发生了变化，导致药效发生了较大的变化。
因此，在提取纯化过程中应选择合适的考察指标。首先要根据多糖的存在形式及提取部位的不同，决定在提取之前是否做预处理。并且，对提取纯化的关键步骤均应进行成分组成及含量、药效的跟踪，以说明工艺的合理性。
3、有效部位的确定
目前，对多糖的研究一般表现为对多糖粗提物的生理活性的研究。多糖提取物的分子量分布较广，在多糖的提取纯化过程中，由于没有对其分子量进行分段，没有进行药效跟踪，没有除去单糖及寡糖等小分子物质，所以常常无法证实有效部位就是多糖。
不同结构的多糖，其药效不同，有的多糖没有明确的药理作用。反之，单糖和寡糖未必没有药理作用。因此，在提取纯化研究中有必要将多糖与单糖、寡糖等小分子物质分开，进行药效比较，说明有效部位所在。
在有效部位清楚后，需要最大限度地保留有效部位，除去其他成份。为此，要根据有效部位成份和杂质的特点选择适宜的分离纯化方法。
二、质量研究方面
1、理化性质及多糖的结构分析
在审评中我们发现，对多糖的理化性质虽有研究，但不系统、不深入。有的仅仅是做一些简单的说明，没有实质性的研究。
对多糖的理化性质研究是保证多糖质量的重要方面。研究资料显示，多糖的活性与分子量、溶解度、粘度、初级结构和高级结构等性质有关。概括起来，具有生理活性的多糖具备的特性是：①水溶性D－葡聚糖；②具线状结构或尽可能短的分枝；③具有D－螺旋型立体结构，且不被体液中的D－葡聚糖酶水解。有些多糖的一级结构相同，但活性不同，其原因是它们的二级结构和三级结构不同。因此搞清多糖中单糖的组成及立体结构具有重要的意义。
由于多糖的活性与分子量、比旋度、溶解度、特性粘度、纯度、初级结构和高级结构等有关，因此应对多糖分子量分布进行研究，对多糖的结构、组成、杂多糖中单糖组成成分进行分析。但对这些性质的研究均需将多糖纯化到一定的纯度如80％以上。所以对于单一多糖组成的新药，则需阐明该多糖中单糖的组成及其摩尔比，说明各组成单糖的连接键型。一般有效部位多糖为杂多糖，则必须阐明该混合多糖有那几种主要多糖组成及各多糖的比例，并说明主要多糖的分子量、组成多糖的单糖的种类及摩尔比。
多糖的结构分析方法有许多，一般为多糖样品经水解进行单糖的组成分析。
纸层析、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱、X-射线纤维衍射、毛细管电泳法等。
其中气相色谱法（GC）测定糖类开始于1958年，具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快等优点，是多糖结构分析中最重要的手段之一。它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方法、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。GC要求试样具有良好的挥发性和热稳定性，多糖本身不能在高温下直接挥发，因而需要将大分子多糖降解为单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发、对热稳定的衍生物，进行测定。
毛细管电泳法（CE）是80年代后期迅速发展起来的一种分离分析技术，它以快速、高效和高灵敏度、所需样品少等特点正被广泛应用。一般多糖经酸或酶水解后进行CE，与标准品对照后计算出各单糖的峰面积进而推算出其单糖组成及其比率。定性分析主要通过进行多糖的指纹图谱来确定糖组成结构的特征。定量分析目前只限于多糖中某特定功能团和组成多糖各单糖的定量分析。
质谱技术如联动扫陈描、MS/MS方法、不同衍生化处理、同位素标记方法、GC/MC和LC/MC以及各软电离技术的配合使用，质谱法在糖的序列分析和结构鉴定研究中正越来越起着重要作用。
X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合可以从原子水平对多糖分子结构进行分析。大多数多糖均不能形成单晶，不适用于常规X-射线单晶衍射。而X-射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间，再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确地确定多糖的构型。尽管研究多糖的立体构型有多种方法如电子衍射、旋光测定、核磁共振等，但X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构型最为有力的工具等。
2、分子量分布研究
在审评中发现，仍有相当一部分多糖类成分的新药研究中没有对多糖的分子量分布进行研究。
从分子量分布情况，可以反映出多糖组分的纯度。对于杂多糖进行分子量分布进行研究，对控制多糖的质量具有重要的意义。因此有必要提供HPLC法测定多糖分子量及分子量分布的研究资料，并用多糖专用的色谱柱进行分析。
多糖的分子量分布分析方法较多如蒸气压法、端基法光散射法、粘度法、凝固点下降法、凝胶过滤法、高效液相色谱法、超过滤法等。2005年版中国药典二部中收载了高效液相色谱法，色谱柱为凝胶柱的分子量分布测定法。
3、鉴别方法研究
目前，多糖有效部位中药新药的质量标准中，对建立专属较强的鉴别方法研究甚少。多糖定性鉴别方法主要包括溶解性、硫酸咔唑反应(阳性)、蒽酮—硫酸试剂反应(阳性)、苯酚—硫酸试剂反应(阳性)、斐林试剂反应(还原糖试验)、双缩脲试验(阴性)、碘—碘化钾反应(阴性)、茚三酮反应(阴性)、三氯化铁反应、十六烷基三甲基溴化铵络合反应、比旋光度、特性粘度、电导率及PH值等。这些指标专属性不强，无法说明多糖的植物或动物来源。可以考虑通过采用药材对照及分子量分布HPLC凝胶色谱指纹图谱的建立来实现。
4、含量测定方法研究
多糖含量测定方法国内多采用显色试剂-硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等缩合成有色化合物。如苯酚-硫酸法生成橙黄色溶液,在490nm处有特殊吸收，如红毛五加多糖、枸杞子多糖、石斛多糖等。蒽酮-硫酸法生成亮绿色溶液在620nm处有特征吸收，其蒽酮试剂需新鲜配制，如麦冬多糖、黄精多糖等。咔唑-硫酸法用于测定糖醛酸类多糖，如银耳多糖等。
国外有用LKB柱层析系统，用比旋度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。
但以上测定方法应是在工艺中或样品前处理中通过透析或过凝胶柱等方法除去单糖、寡糖及小分子物质的前提下或在质量标准中增加单糖检查项，不得检出单糖的情况下是可行。
有的新药研究中将中性多糖和酸性多糖的含量相加说明有效成分的量符合有效部位的要求。但两类多糖的测定方法之间有干扰，因此结果的可靠性存在疑问。
中性糖的测定方法一般采用苯酚硫酸法或硫酸-蒽酮法以葡萄糖或以组成多糖的单糖中含量较高的单糖为对照进行测定；而酸性多糖一般采用硫酸咔唑法或联苯硫酸法以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸为对照进行测定。中性多糖和酸性多糖往往在多糖提取过程中一并提出，文献报道酸性多糖对中性多糖的含量测定有干扰，而中性多糖对酸性多糖的测定亦有干扰，在确定有效部位总多糖含量时，除应减去单糖或寡糖的含量外，还应考虑酸性多糖和中性多糖两方法之间的相互干扰，并应考察干扰程度，分析是否可以忽略不计，以说明测定方法的可行性。
三、小结
1、目前多糖类有效部位的研究主要存在的问题是工艺研究中，没有进行分子量分布及药效跟踪研究，没有找到真正发挥疗效的有效多糖，说明有效部位为多糖的依据不足。质量控制方面，没有将关键的质控指标列入标准，如分子量分布、单糖检查等。尽管多糖的结构复杂，研究的难度大，并且多糖的结构测定有自身的难度和特殊性，给多糖的研究和临床应用带来了很大的限制。但仍应通过对多糖进行深入的研究，规范多糖的提取方法，说明多糖的构效关系以及多糖的组成与生物活性的相关性，来促进多糖研究的深入。
2、随着中药分析化学技术的进步和研究方法的不断丰富，在多糖类有效部位新药的研究中，应更多地采用先进的技术手段，以提高多糖类新药的质量控制水平。

请问：我用pet-32表达了我的目标蛋白，想用做抗原制备多克隆抗体。目标蛋白是以包含体的形式表达的融合蛋白，我用8M的尿素进行溶解后上Ni柱进行纯化，但整个过程中遇到了很多的问题，以前没有做过，还是菜鸟。请大家帮帮忙，在此先谢过！我遇到的问题有：
1、溶解效果不好：菌体加含8M的尿素的磷酸缓冲液后用超声波破菌，室温溶解1小时以上，甚至过夜溶解，溶解效果均很理想，虽然溶解了一部分，但是大多数还在沉淀里。我也做过含尿素梯度的缓冲液，我的目标蛋白在0.5M的尿素就有溶解，好像增加尿素的浓度对他的溶解影响不大一样，我想换用盐酸胍溶解，但是后面又要上柱子，不知道有没有影响，此外含盐酸胍的样品不能直接跑SDS-PAGE，所以很是郁闷。
2、Ni柱吸附样品不够好：将溶有我目标蛋白的样品上Ni柱进行纯化，但是上样前后的样品跑SDS-PAGE分析，没有多大的变化。纯化过程发现有很多的非特异性吸附。纯化后样品不够纯，大概只有50%。
3、纯度较高的浓度过低：由于要用于免疫，要求蛋白浓度要达到2mg/ml。但我的纯品很少，并且浓度过低，由于实验条件有限，浓缩样品又是一大难题。实验室没有冷冻干燥的装置，也不能用超滤，打算选用透析来浓缩，但是透析用的PEG会进入到样品中，这对免疫兔子影响是否会很大？会不会导致兔子死亡？有什么方法可以浓缩蛋白后将PEG去除？
4、此外是否可以用包含体的沉淀来免疫兔子？如果沉淀纯度够高的话
恳请高手们指教，盼回！谢谢！

最近做了taq酶的表达和纯化，将优化的实验流程和一点心得贴上来，希望对大家有帮助，更希望得到批评和指正

TaqDNA聚合酶表达载体的构建与提取纯化

1.背景

重组TaqDNA聚合酶基因及表达载体插入重组TaqDNA聚合酶基因的pET-28a表达质粒，该质粒是由美国Novagen公司推出的能在大肠杆菌中高效表达的一种质粒载体。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子，在T7启动子前有1个6×His-Tagcoding序列，是T7的增强子，多克隆位点上有NcoI—Xhol11个酶切位点，载体上还有1个卡那霉素(Kan)的筛选标记。重组的TaqDNA聚合酶基因通过NdeI和Xhol双酶切克隆在表达质粒pET-28a多克隆位点上。
宿主菌为BL21(DE3)。菌株，即宿主菌BL21经噬菌体DE3溶源化后，DE3的lacUV5强启动子及位于其下游的T7RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在非代谢性乳糖类似物IPTG的诱导作用下能产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特异性地识别Pet-28a表达载体中的T7启动子序列，从而高效地表达目的重组蛋白。由于IPTG不会被宿主菌利用，因此向培养液中加入少量的IPTG就能lacUV5强启动子产生持久的诱导作用。

2.材料与方法

1）.TaqDNA聚合酶表达载体构建
Nde1,Sal1双酶切通过pcr引进此双酶切位点taq酶基因，经过T4连接酶连接，将长度为2496bp的taq聚合酶基因，插入同样双酶切的PET28a载体中。
2）.工程菌的转化
通过热击转化的方法，将连接产物转化BL21(DE3)表达菌株，通过菌落pcr,提取质粒酶切鉴定确认taq酶基因已经确实插入PET28a载体，送表达菌株测序验证。
3）.TaqDNA聚合酶基因的诱导表达
取已鉴定的阳性克隆，转接20ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，活化转化细胞。活化后，再取2mL培养液，转接到200mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、150r／mim振荡培养3.5h左右，至OD值=1.0时，加入表达诱导剂(IPTG)，至终浓度1．0mmol／L，继续在37℃,150r／min条件下振荡培养，诱导表达，诱导8小时后制备。（转接量、诱导起始时间。诱导用IPTG浓度、诱导时间已经经过系统优化）
4）.10000g/4℃/5min收集菌体，用50ml缓冲液A（20mMTris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）洗涤，10000g/4℃/3min，20ml缓冲液A重悬，4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，75℃水浴45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白。上清中加入硫酸铵（4M的母液PH8.0）使其终浓度为1.6M，室温磁力搅拌器搅拌30分钟，12000g/室温/20分钟，用缓冲液B（20mMTris-HCL,100mMKCl,0.5mMEDTA,1mMDTT,0.5℅吐温-20,0.5℅NP-40,50℅甘油，PH8.0）重悬，酶液用缓冲液B4℃透析过夜。
5）.步骤4所得到的酶液即可用于检测实验，为了得到更纯的酶，粗蛋白经中速滤纸过滤后过QsepharoseFF,收集穿透液，再利用工程菌表达的6His作为纯化标记。上清(补足NaCl至终浓度为0.5M)流过已螯合Ni的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mMTris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0,5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mMTris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/30mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mMTris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0,200mM咪唑）洗脱目的蛋白（SDS-PAGE检测蛋白纯度可达到85%以上）。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液即步骤4中的缓冲液B。（也可以将洗脱下来的酶液用2M终浓度硫酸铵沉淀后离心，沉淀用酶保存缓冲液溶解，对检测实验没有影响）
反应缓冲液中的镁离子浓度可以根据具体实验需要进行调整

3.检测

纯化后的酶十倍稀释，荧光定量PCR检测活性
SDS-PAGE检测纯度。

4.总结与心得

1）.实验前的准备工作是实验成功的基石，广义的讲：这包括实验大方向的确定、原始文献阅读、基因序列的查找比对、基础工作的准备、每一步实验的分析总结。做好每一步实验的科学分析可以避免后续实验的失败还可以给自己每一小步都成功的感觉，做研发，需要给自己信心。
2）.做好预实验，也就是在实验中做好阳性对照和阴性对照，这有助于我们实验结果的分析。举个例子：做转化时，我们加上质粒转化验证感受态没有问题，加上感受态细胞转化抗生素平板验证感受态没有被污染，这样，无论是什么样的转化结果（包括平板筛选结果）都可以得到很好的分析。
3）.用实验结果证明实验方法的成功与否，在蛋白纯化过程中，特别是在过阴离子柱或者阳离子柱时，凭空想象的离子浓度和PH值是不可取的，只有通过线性的离子浓度和PH值摸索纯化条件、数次重复对比实验，用真实的实验结果来确定所使用的实验条件。
4）.认真原始阅读文献，尽量用最符合生物科学的方法来解决问题，在实验过程中可以参照文献的实验方法，但一切用实验结果说话。

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。

抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。

抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤

多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

具体实验步骤如下：

1.兔子的准备

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.

预采血（作阴性参照用）

1.1将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；

1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；

1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；

1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。

2.兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；

2.3小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测

3.12个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时。

3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。

3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma单组份TMB）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

3.8每孔加入50ul的终止液（2NH2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化

4.抗体的亲和---亲和柱的制备

4.1称取1mgCNBr-Sepherose4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。

4.2将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml2mmol／L的盐酸洗介质3次。

4.3用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。

4.4将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中

4.5室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。

4.6加入15ml1%BSA溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。

4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.

4.8抗原固相化完成，可用于纯化。

4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的纯化和保存

5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.

5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜

5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白

5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体

5.7用10倍体积PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。

各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！
1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？
2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。
再次谢过！！

实验室纯化了一个蛋白，但是在包涵体复性时使用了变性剂，但透析时透析液里没有没有去垢剂，不知道过分子筛时对柱子有没有什么影响？请教各位大侠，**

众所周知，糖类化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源，是生物体合成其它化合物的基本原料，或充当生物体的结构原料。糖类化学的研究较早，但在核酸、蛋白质的研究处于鼎盛时期，对糖类化合物的研究一度受到冷落。直到20世纪70年代后，随着分子生物学的发展，人们逐步认识到，糖类是涉及生命活动本质的生物大分子之一糖类具有多个羟基，糖苷键又有α、β构型之分，单糖的连接可能产生数目很大的异构体，因此，糖链结构蕴含十分丰富的生物语言信息，是高密度的信息载体。
　　细胞是生物体的基本单位，种类繁多的细胞形成各种组织，所有细胞表面均覆盖着一层糖被。糖常常和蛋白质构成共价复合物—糖蛋白。许多酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素等大多数蛋白质都是糖蛋白。在糖蛋白中，各种糖蛋白糖链的长短与结构，糖链的数目均相差很大，因而含糖量也相差很大。例如：卵白蛋白分子含一条糖链；而羊的颔下腺粘蛋白分子含800条寡糖链，焦原蛋白含糖量不到1%；可溶性血型物质含糖量高达85%。细胞与细胞的相互粘附、相互识别、相互作用、相互制约与调控均与糖蛋白的糖链有关。随着分子生物学的飞速发展，生命的奥秘正在逐渐被揭示。大量的研究已表明，各种错综复杂的生命现象的产生与疾病的形成过程均包含了许多分子变化和复杂的代谢过程，其中糖蛋白的糖链在受精、发生、发育、分化、炎症与自身免疫疾病，在癌细胞异常增殖及转移，病原体感染，植物与病原体相互作用，豆科植物与根瘤菌的共生过程中，都起到重要作用。糖生物学的研究方兴未艾，成为继蛋白质，核酸后又一热点领域。英国、日本、美国及欧洲一些发达国家均十分重视糖生物学的研究，出版了多种杂志，专门介绍糖生物学研究的进展。90年代以来，国际召开了一系列重大糖生物学学术研讨会议。1993年，在美国召开的首届糖工程会议上，主持人G.W.Hart说：“糖生物化学中，最后一巨大前沿糖生物学的时代，正在加速来临！”本章编选了部分糖生物化学知识，旨在促进对糖研究领域的了解及其重要性的认识。
第一节凝集素及其在生物学中的作用
　　一、凝集素的概念
　　凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。
　　Sumner和Howell于1936年首先从刀豆(jackbean,Canavaliaensiformis)种子纯化了伴刀豆凝集素ConA。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推测ConA的血凝作用是与细胞表面糖作用的结果。
　　目前已有近千种植物被测得具有凝集素活性，植物中，不只种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果实汁中也发现有凝集素。除植物外，其它生物，如各种真菌、某些病毒、无脊椎动物、脊椎动物乃至人体的各种组织和器官中都存在凝集素。
凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；±唾液酸。在植物凝集素中，只有麦胚凝集素（WGA）可专一结合唾液酸。除按糖结合专一性分类，还有按来源、按结构等其它分类方法，不在此详述。

　　二、凝集素与疾病
　　细胞间的粘附是细胞间相互作用起决定性作用的起始步骤。作为致病的微生物，首先对宿主细胞进行粘着，然后才能感染和致病。细胞表面的凝集素能专一地识别并结合另一细胞的糖链。凝集素的这种特性，在细胞与细胞，细胞与基质的粘附中起一定作用。
　　动物Se凝集素与炎症
　　1990年11月，三个不同的研究小组几乎同时发现了血管内皮细胞，与白细胞粘附分子选择素（Selection）。这是一类与白细胞运行与粘着相关动物凝集素，除E外还有L与P型。三种凝集素均可识别唾液酸化的四聚糖。
　　L型Se凝集素存在于淋巴细胞表面，可使血液循环系统中的淋巴细胞与淋巴节间产生器官专一性的粘着作用而使淋巴细胞分流回到淋巴系统，称其为淋巴细胞“归巢”。E型Se凝集素存在于内皮细胞表面。当组织受到损伤或感染时，白细胞与内皮细胞粘附，沿壁滚动，最后穿过血管壁进入受损组织以杀灭入侵病原物。过多的白细胞渗出则能引起炎症。在类风湿性关节炎等慢性炎症，银屑病等皮肤炎症病人，均检测到E-Se凝集素的增强。在结肠癌和肺癌细胞表面均发现有SLex的抗原决定簇。这些癌细胞容易和带有E型Se凝集素的内皮细胞结合，渗出血管而导致癌的转移。E、P、L至少三种凝集素与寡糖SLex之间的识别功能及与炎症、癌症的关系的阐明被认为是糖生物学研究的一场**，并引发了设计抗炎药物、抗癌药物的新思路。
　　炎症时，局部内皮细胞表面Se凝集素的表达加剧，导致白细胞在炎症部位大量堆积。若能抑制白细胞在内皮细胞表面的粘着，可能达到抗炎目的。SLex就是一种有效的抗炎药物。美国Scripps研究所华裔科学家王启辉用三种不同的糖基转移酶合成了SLex，取得世人瞩目的研究进展。利用核磁共振技术测定了SLex的立体结构。从近7500种化合物的结构数据库中找到了约400种和SLex结构相近的非糖化合物；其中有23种商品的化合物和药效团的结构更为接近，从中又筛选出甘草甜素与甘草酸与E、P、L型凝集素有着不同程度结合能力，因而具抗炎活性。
　　三、凝集素在生物学研究中的作用
　　由于凝集素与糖分子具有专一性可逆结合的特性，将凝集素固定化制成亲和层析柱用于对糖、糖肽、糖蛋白的分离纯化。可用于糖复合物的检测与鉴定。利用辣根过氧化物酶等方法标记的凝集素可用于糖复合物的组织化学检测与定位。可用于血型的鉴定，国外一些血库已用凝集素取代了血清。能够促进淋巴细胞的有丝分裂。除上述作用外，凝集素在以下几方面的应用前景更令人关注。
　　1、用于恶性肿瘤的诊断
　　前已述及，癌变的细胞其糖蛋白糖链与正常细胞相比有很大的变异。利用凝集素能专一性地识别糖链的功能，选择1种以上的凝集素对病人尿与血清中的糖蛋白进行检测，可对肿瘤诊断提供重要信息。例如诊断原发性肝癌涉及到甲胎蛋白.AEP是胎儿发育过程中，由胎肝合成的一种含糖量为4%的糖蛋白，由590个氨基酸残基组成。每分子AFP含一条糖链。胎儿出生时，脐带血中含AFP为10-100mg/L，出生1年后，降至与正常人水平，含量极低，难以检测。原发性肝癌病人血清AFP明显上升，因此临床上用免疫生化技术测定AFP做为诊断肝癌的依据。以后的研究表明胃癌、肠癌、胰腺癌等消化系统肿瘤血清AFP含量也升高，而肝炎、肝硬化病人血清也可伴有暂时性的AFP上升。
　　如何区别肝癌与良性肝病，肝癌与其它癌症,进一步的研究表明，肝癌AFP糖链最明显的变化是岩藻糖增加，而良性肝病无此变化。用岩藻糖化的AFP，借助凝集素可区分肝癌与良性肝病。肝癌AFP除岩藻糖增多外，（bis-GLCNAC）型天线也增多，ConA（刀豆凝集素）LCAC（小扁豆凝集素）WGA（麦胚凝集素）E-PHA（红腰豆凝集素）PSA（蔓陀罗凝集素）等与受体糖链结合各有其特异性。例如PSA只结合多天线和偏二天线糖链；而ConA能与PSA不结合的C2C2二天线和单天线糖链结合。利用AFP与不同的凝集素相互作用的特点，后经现代分离分析手段分离检测，即可将肝癌及其它癌症相区别。
　　2、按抗粘附机制，设计防治病毒与细菌致病的药物
　　由于病毒与细菌等病原体对受体细胞的识别与粘着是感染及引发疾病的第一步，那么阻断病原体对受体细胞的粘着，以凝集素为基础的药物设计应该是防治这类疾病最直接、最有效的途径。例如a-甲基甘露糖苷与大肠杆菌表面的凝集素结合，大肠杆菌则无法再与动物尿路表皮细胞的糖链结合，即无法与宿主细胞粘着。a-甲基甘露糖苷有可能成为防治尿路感染的药物。
　　胃炎和胃溃疡是由幽门螺旋杆菌感染致病的。在研究了螺旋杆菌的凝集素及糖结合专一性后，美国Neose公司开始酶促合成具抗粘附活性的糖类药物，并用于临床试验。
　　艾滋病致病病毒HIV对受体感染的分子基础不十分清楚。但一些研究表明，对甘露糖专一的凝集素在不同程度上可以影响HIV的感染。前面提到，gp120凝集素活性是与甘露糖基等结合，这就为艾滋病的防治提供了又一新的思路与线索。
3、生物导弹的研制
　　“生物导弹”通常是指治疗肿瘤的抗体和毒素形成的复合物免疫毒素。在复合物中，抗体由于能识别并与肿瘤细胞粘着而起到定向传送的作用，毒素部分则起到杀伤肿瘤细胞的弹头作用。由于抗肿瘤药物对机体产生的毒副作用，既要维持血药浓度不变又要对病灶有足够的杀伤力，生物导弹是解决这一矛盾的最佳策略。
　　一些凝集素和特定结构的糖链也可以象单克隆抗体那样起到导航作用，把杀伤癌细胞的药物定向传送到病变组织。例如肝细胞凝集素可以专一性地识别半乳糖，将药物与带有半乳糖的糖蛋白偶联，因糖蛋白可以和肝细胞凝集素专一性地结合，并使药物定向导入肝细胞，可达到治疗肝癌的目的。但凝集素或糖复合物作为药物定向传送的载体在理论上可行，在实际应用上，尚有许多问题有待于进一步解决。

第二节糖类与生物信息分子
　　一、糖类物质与血型
1900年，K.Landsteiner发现，人类的主要血型有A型、B型、AB型和O型。由于血型在输血、组织和器官移植及法医鉴定中的独特作用，尤其是在第一次世界大战中抢救伤员所做的重大贡献，K.Landsteiner获1930年诺贝尔医学奖。那么人类的血型是由什么物质决定的呢？科学家经过半个多世纪的研究，1960年由W.M.Watikins确定了决定血型的是糖蛋白中寡糖链末端糖基组成的不同，O型血型物质糖链末端半乳糖连接的仅是岩藻糖；A型是半乳糖上除连接岩藻糖外还连有N-乙酰氨基半乳糖；B型物质与A型相比，是由半乳糖代替了N-Z酰氨基半乳糖；AB型是A型与B型末端糖基的总和。

　　二、寡糖链与分子识别与细胞识别
　　
有重要生物功能的酶、激素、抗体和一些受体均是糖蛋白。人体红血球正常值为400-550000/mm3，白血球正常值为4000-10000/mm3。每个红血球细胞膜上约有50个糖蛋白（载糖蛋白A）分子，每个白血球细胞膜上也有约50万个糖蛋白（白唾液酸蛋白）分子。生命机体内如此众多的糖蛋白中，寡糖链的生物功能是什么？近年来，由于寡糖链生物功能研究方法的进步，使这一领域的研究取得突飞猛进的发展。大量的研究资料表明，寡糖链最重要的生物功能是参与分子识别及细胞识别。识别是重要的生命现象。生物细胞有多种多样的识别机制。识别由细胞外具有识别能力的分子与位于细胞质膜的具有可被识别标记的专一受体结合起始，或从不同细胞膜两种成份专一结合起始。这种结合可能诱导细胞生理和代谢状态的改变。识别机制可引导细胞作为细胞社会的一员正确行使自己的工作职责。以糖为识别标记的生命活动在生物体中广泛存在。
　　1．流感病毒对受体糖链的识别
　　流行性感冒病毒对细胞的侵袭依赖于病毒分子对细胞膜上糖复合物糖链末端唾液酸的识别与结合。其中A型和B型病毒识别5-乙酰神经氨酸或5-羟乙酰神经氨酸。如5-乙酰神经唾液酸广泛分布于细菌和动物组织中，是糖脂及糖蛋白的组成成份，唾液酸是20余种神经氨酸的总称。神经氨酸的9位羟基如被乙酰化，则不能被A型或B型流感病毒识别特定结构的唾液酸（5-乙酰神经氨酸），5-乙酰神经氨乙酯酸可介导病毒的粘着和侵入，同时也可被相应病毒的唾液酸酶所水解。各型病毒唾液酸的水解有利于病毒从细胞上脱落，从而使病毒对细胞的入侵受阻。但这种阻碍作用对其它类型病毒无效，此即人们反复易患流感的原因。流感是人群中的高发病常见病。人们一直试图制备流毒疫苗使人体具备抵御流感病毒的免疫能力。但流感病毒在遗传上常会发生变异称为转移。经过一段时期还能剧烈地变异称为漂移。转移与漂移均引起流感病毒抗原性的变化，因而从免疫的角度防治流感无法取得显著效果。
　　流感病毒无论发生怎样的变异，都需先和宿主细胞表面的糖蛋白相互识别、相互作用，即先发生粘着，然后才能感染，对流感病毒粘着的机制比较清楚。从抗流感病毒粘着的角度设计防治流感的药物，将对流感的防治开辟新的思路与途径。
　　2．细菌对受体糖糖链的识别
　　细菌对人体组织细胞的侵袭有一定的特异性。例如肺炎球菌只感染肺和脑膜，因为肺炎球菌能专一性地识别两组织细胞表面糖链中的N-乙酰氨基葡萄糖；嗜腐球菌能感染呼吸和泌尿系统，因该细菌能识别两组织细胞表面糖链的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖。
　　3．糖蛋白寡糖链在精卵识别中的作用
　　哺乳动物的受精是卵巢排出的成熟卵子和已经获能的精子在输卵管内相遇而融合的过程。精子与卵细胞的结合具有极强的专一性，包括科属专一性与细胞专一性。精子首先和包被在卵子细胞膜外层的透明带的糖蛋白相互作用。透明带可作为精子受体并阻断多精受精。已知小鼠的透明带由分子量分别为20万、12万、8.3万的三种糖蛋白ZP-1，ZP-2，和ZP-3组成；猪透明带具有分子量为9万和5.5万两种分子量的ZP-1与ZP-3的糖蛋白。
　　受精初期，卵透明带与精子结合，并诱发精子顶体反应起主要作用的是糖蛋白ZP-3。精子表面具有识别糖基活性的蛋白质（凝集素），可识别ZP-3、O-乙酰氨基半乳糖链上的α-半乳糖。在顶体外膜与精子细胞膜融合、释放顶体内容物，形成囊胞后脱离精子并暴露顶体内膜，ZP-2的作用被认为是与暴露的顶体内膜结合，维持已发生顶体反应的精子，不从透明带上脱落。只有经过顶体反应的精子才能穿过透明带，与卵子细胞膜融合，完成受精过程。受精过程又触发卵子的皮质颗粒向细胞膜移动。在顶体反应中ZP-3可能被修饰，因此不能再作为精子受体。实验表明，透明带中的三种糖蛋白，只有ZP-3在离体情况下可干扰精子与卵子的结合，而且只有从未受精的卵制备的ZP-3才有效。当小鼠的ZP-3用三氟甲烷磺酸去除糖链后就不能阻断精卵结合，用稀碱水解法去除O-乙酰氨基半乳糖糖链也有同样效果。
　　精卵结合是一个复杂的生物学过程，精卵识别的分子基础与糖蛋白的糖链密切相关。精卵识别本质的进一步阐明对新避孕药的设计与开发具有重要的指导意义。

第三节糖蛋白的糖链结构与疾病
　　糖蛋白中的糖链是在蛋白质合成后被接到肽链特定位点上。糖链的存在对肽链的折叠聚合、溶解及降解均有重要影响。在疾病状态下，代谢的异常引起糖链结构的异常，进而导致糖蛋白及所在细胞的功能失常，乃至形成恶性肿瘤细胞。结构异常的糖链如被人体免疫系统当作异物识别，可产生自身抗体引起自身免疫性疾病。
　　一、糖链结构与恶性肿瘤
　　肿瘤的发生、浸润、转移是一个复杂的生物学过程，大致分为以下阶段：1.肿瘤生长、浸润及肿瘤细胞从原位释放；2.肿瘤细胞向淋巴系统或血液系统运动；肿瘤细胞在循环中存活并与血小板和凝血系统相互作用；肿瘤细胞通过与远位淋巴或血管内皮细胞和内皮下基质相互作用而在该位置停留；肿瘤细胞迁移入组织实质中；肿瘤细胞在组织实质中生长。上述全过程均与细胞表面起粘附作用糖蛋白的糖链直接或间接有关。
　　细胞癌变后，细胞表面作为可被识别的标记物发生了改变。近年来的研究表明：糖蛋白中的糖链分子量的增加是恶性肿瘤的普遍现象，主要表现为：
　　1.天线数增加
　　在糖蛋白中，一类为N-糖链，是指连在肽链上天门冬酰胺侧链的酰胺氮上，复杂型N糖链有不同数量的分支糖链。目前借用电子学上的术语“天线”来形象描述复杂型N-糖链的分支结构，每一条糖链称为1条天线。天线数增加是肝癌、胃癌、肠癌、食管鳞状上皮癌、乳腺癌等肿瘤最常见的糖链变化，天线数往往由正常情况下的二天线转变为三天线或四天线。有报道认为，三、四天线可能与恶习性肿瘤的转移潜力有正比关系。
　　2.N-乙酰氨基乳糖重复顺序出现或增加
　　[Galβ1,4GlcNACβ1,3]n这一重复顺序在正常细胞的糖蛋白中比较少见，而在恶习性肿瘤的糖蛋白中则出现或增多。
　　3.核心岩藻糖增加
　　核心岩藻糖（c-Fuc）是指N-糖链核心五糖中最内侧（与Asn相连）GlcNAC连接的α1，6Fuc。在肿瘤糖蛋白中c-Fuc往往增加。例如前面提到的，原发性肝癌。甲肽蛋白AFP浓度明显上升。研究表明，岩藻糖增加是肝癌糖链最明显的变化，消化道癌分泌的AFP也有岩藻糖增加的现象。
　　4.出现偏二天线
　　偏二天线糖链是指两条天线连接于同一1，3臂α-Man的C2和C4位上。这种不正常糖链只存在于恶性肿瘤中。有人认为肿瘤特异性偏二天线糖链可制备单克隆抗体用于肿瘤的诊断及导向治疗。例如绒毛膜上皮癌晨尿中的人绒毛膜促性腺素（hCG）中即出现较大量的偏二天线。
　　在恶性肿瘤中，糖蛋白糖链结构除上述异常现象外，还有平分型N-乙酰氨基葡萄糖增加；外链岩藻糖增多，末端N-乙酰神经氨酸的变化连接键的改变，高甘露糖型N-糖链的出现或增加等。
　　二、IgG糖链结构与类风湿性关节炎
　　免疫球蛋白G（IgG）也是一种糖蛋白，含糖量大于3%，对IgG蛋白部分的结构与功能已较明了，但对糖链结构与功能却知之甚少，直到1981年，T.Deisenhofer用X-射线晶体分析确定了糖链的结构与IgG的结合位点。1985年，木幡阳发现IgG的N-糖链种类很复杂，可达30余种。少年类风湿病人血清中的IgG的N-糖链的种类与正常IgG相比有很大差异。主要是外链中半乳糖的含量明显下降而以N-乙酰氨基葡萄糖为末端的糖链明显比例增加。
　　IgG的N-糖链在缺失外链半乳糖后，可成为一种自身抗原，被免疫系统识别而产生自身抗体。这种抗原与抗体结合生成免疫复合物，沉积于关节内，引起炎症。最近的研究还表明，体内的甘露糖结合蛋白可识别外侧缺失半乳糖的乙酰氨基葡萄糖，使甘露糖结合蛋白和IgG的Fc段结合，并激活补体，这也是引起关节炎的另一因素。此外，系统性红斑狼疮患者血清中的IgG也有糖链缺失半乳糖的变化。
第四节糖类药物的开发与应用
　　随着分子生物学的飞速发展，糖的生物功能已被逐步揭示和认识。多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老，能增强机体的免疫功能等。20世纪70年代，对多糖生物活性的研究领域日趋广泛，相继发现糖类物质具有抗炎、抗病毒、抗辐射、降血脂、抗水肿、抗消化性溃疡、诱导干扰素产生、促进蛋白质、核酸生物合成等功能。80年代后，发现一些天然的或人工合成的多糖硫酸酯对艾滋病病毒有明显的抑制作用，这引起了人们极大的关注与兴趣。目前，全世界对糖类药物的研制与开发空前活跃，有些药物已投放市场，已从天然产物中分离出300种以上糖类化合物，并进行了生物功能的检测。已有数种多糖类药物用于临床。下面简要介绍几种多糖药物及多糖药物的作用机理。
　　一、多糖类药物的作用机理
　　人体内发挥免疫功能的系统是由分散在全身的补体、抗体、淋巴因子、吞噬细胞、淋巴细胞、淋巴结、胸腺、脾脏等分子及细胞与器官组成，它们之间靠血液与体液相互沟通，相互配合，相互协调，使人体发挥正常的免疫功能。
　　多糖类药物主要作用于免疫系统。实验表明，多糖增强机体免疫功能主要表现在：
　　1．对细胞吞噬功能的影响
　　机体中单核巨噬细胞系统、淋巴细胞系统和粒细胞系统能吞噬细菌、真菌等病原体，能清除吞噬衰亡突变的细胞（如癌细胞）及其异物的作用。据文献报道，银耳多糖、枸杞多糖、甘草多糖、杜仲多糖、竹节人参多糖、虫草多糖均能激活巨噬细胞、网状内皮细胞吞噬的功能。鹿茸多糖、灵芝多糖等可调节淋巴细胞系统，明显增加免疫能力低下的小鼠的T细胞总数，促进小鼠淋巴细胞的的转化等。
　　对多种多糖抗肿瘤作用机理的研究表明，多糖类药物并非直接杀死癌细胞，而是通过刺激机体各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，使机体免疫系统恢复平衡，发挥机体自身的抵抗力去清除、吞噬癌细胞。
　　2．多糖药物能激活补体系统
　　血清中的补体系统由9种血清球蛋白组成。补体能协助、配合吞噬细胞杀灭病原微生物。促进被细菌、病毒感染细胞的溶解与死亡。有实验证明，因中华眼镜蛇蛇毒因子造成的动物低补体状态，在黄花、党参、人参多糖的作用下，补体活性明显提高。
　　3．多糖药物可促进干扰素及其它细胞活性因子的产生
　　1957年Isancs和Lindermann在研究病毒干扰现象过程中发现的一种因病毒及其它诱生剂诱生的一种保护周围细胞抗病毒感染的糖蛋白。干扰素因具有控制病毒细胞复制、抑制肿瘤生长和调节免疫活性细胞而广泛应用于抗病毒、抗肿瘤的临床治疗。
　　白细胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、肿瘤坏死因子（TNF）是由免疫活性细胞释放的，具有调节细胞功能的高活性、低分子量的多肽或蛋白质。这些生物活性因子能作用于淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。多糖类药物能促进干扰素的产生。实验表明甘草多糖、树舌多糖，对促进人的血细胞、单核细胞干扰素的产生均有诱生与协同作用。黄芪多糖、商陆多糖、牛膝多糖等均能提高白细胞介素、肿瘤坏死因子的活性。
　　我国传统中药其精髓是扶正固本作用。目前从100多种中药中提取的多糖类化合物具有免疫促进作用，这对深入阐明中药的作用机理将提供有力佐证。
　　二、临床应用于抗肿瘤的真菌多糖
　　目前，人们尚没寻找到根治癌症有满意疗效的药物。一些化疗药物如5-F-尿嘧啶，环磷酰胺等对癌细胞有较强的杀伤力，但它敌我不分，在杀死癌细胞的同时，也同样损伤正常细胞，损害免疫系统。多糖药物辅助治疗癌症因无毒副作用而备受人们的关注。
　　1．香菇多糖
　　从人工栽培香菇[entinusedodes(Berk)]的实体中分离纯化的葡聚糖，由β（1-3）糖苷键构成主链骨架，每5个糖残基有β（1-6）键形成的2个分支点，日本已将香菇多糖注射液（静脉给药）应用于胃癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌等癌证的治疗。临床表明，香菇多糖可提高病人50%生存时间，而且无副作用。中国科学院上海药物所、东北师大生命科学学院也将静脉注射香菇多糖研制成功。
　　2．裂褶菌多糖
　　裂褶菌多糖是由高等真菌裂褶菌（Schinophyllumcommune）分离纯化的β（1-3）糖苷键构成主链骨架，6位上有分支的葡聚糖。1986年日本采用深层发酵法生产该多糖，临床上主要应用治疗子宫颈癌。
　　3．云芝多糖
　　云芝多糖是由真菌(CoriolusVersicola)发酵菌丝中分离的由β（1-3），与β（1-4）葡聚糖构成的主链骨架，侧链为β（1-6）葡聚糖，因多糖中含有15%的结合蛋白又称其为云芝糖肽。
　　70年代日本用云芝糖肽治疗食管癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤及急、慢性肝炎。东北师大生物系研制，由长春化学制药厂生产的云芝肝泰是从长白山采集的云芝子实体中提取的多糖，当时主要用于治疗肝炎，曾为该厂带来巨大的经济效益。
　　4．茯苓多糖
　　从真菌茯苓poriacocos(Schco)的子实体中分离到的β（1-3）葡聚糖，含少量β（1-6）葡萄糖残基构成的侧链。将该多糖进行化学修饰制成羧甲基茯苓多糖，在临床上主要用于鼻咽癌、胃癌的治疗。
　　三、具有抗艾滋病作用的硫酸化多糖
　　艾滋病（AIDS）正以极快的速度在全球蔓延。据世界卫生组织（WHO）预测，20世纪最后一年，全球将有4000万人感染上艾滋病。中国艾滋病感染者也呈现出持续增加的趋势。艾滋病致病病毒HIV-1致病能力强，属于反转录病毒科、慢性病病毒属。目前应用最广泛的艾滋病治疗药物AZT（叠氮胸苷）、二脱氧肌苷是一种3脱氧的碱基类似物，是逆转录酶的抑制剂，有较大的毒副作用。世界卫生组织希望开发天然抗艾滋病药物。
　　20世纪80年代以来，一些天然的含硫酸根多糖如角叉芽胶（Carrageenin）、肝素（Heparin）、硫酸软骨素（Choodroition）从堇菜和夏枯草中分离出来的硫酸化多糖，等对HIV均有抑制作用，分析其作用机理可能有三条途径：硫酸化的糖能抑制逆转录酶的活性；是能抑制靶细胞与病毒结合；是能增强机体免疫功能。
　　进一步研究表明，从海藻中提取的原卡拉胶多糖的硫酸酯可以阻断病毒对细胞的吸附。并抑制HIV的逆转录酶。地衣多糖和右旋糖苷的硫酸酯能有效抑制HIV-I的感染与复制能力。将右旋糖苷硫酸酯与AZT合并用于AIDS病人，可减少AZT的用药计量和降低毒副作用。1987年，德国Bayer公司与Hoechse公司联合研制了分子量为6000命名为Hoe/Bay946的木聚糖硫酸酯，可干扰HIV病毒穿透进入受体CD4细胞，此药试用于临床取得良好效果，并且无明显毒副作用。硫酸化多糖有希望成为高效低毒的治疗艾滋病药物。
　　四、壳聚糖的开发与应用
　　甲壳质是一种与纤维素类似的含氮多糖类物质。广泛存在于虾、蟹、昆虫的外骨骼及真菌的细胞壁中。在自然界中，年生物合成量约为1X109-1X1011吨。是地球上仅次于纤维素的第二大类有机资源。甲壳质及其脱乙酰衍生物壳聚糖可广泛应用于工业、医药、食品、日用化工、国防、环保、农业等科技领域。国际社会十分重视甲壳质再生资源的研究开发。至1977年在美国波士顿召开第一届国际甲壳质壳聚糖学术会议，1982年在日本召开第二届会议，至今已先后召开了六届国际学术会议。近二十年，甲壳质开发应用研究突飞猛进硕果累累。每年研究论文上万篇，申请的专利3000件，全世界从事商品开发的企业达千余家。有人说：“从来没有一种物质像甲壳质样，被如此广泛地研究和应用”，“二十一世纪多糖的研究最有希望的是甲壳质”无论这些观点是否准确，但足以说明人们对甲壳质研究的重视。
　　１、壳聚糖的制备
　　提取甲壳质通常以虾壳、蟹壳为原料，虾壳含量约为20%-25%，蟹壳含量约为15%-18%。甲壳质的化学结构如下：
　　（１）虾壳、蟹壳清洗成净壳——脱蛋白——浸酸脱钙——粗甲壳质
　　（２）漂白
　　粗甲壳质0.5%KmnO4浸泡1h水洗——1%苯酸60-70℃、30分钟——水洗干燥
　　（３）脱乙酰基甲壳质——5%NaOH、140℃、1h———白色壳聚糖—————白色甲壳质　甲壳质壳聚糖
　　２、壳聚糖的性质
甲壳质为无定型物质，不溶于一般有机酸和水，难于被机体利用。
壳聚糖为结晶型粉末，能溶于部分有机酸和无机酸。
　　（１）壳聚糖的粘性
　　在酸性水溶液中，壳聚糖分子中的氨基、羟基等极性基团与水分子相互作用而水合，壳聚糖具有较高的粘度。
　　（２）壳聚糖的吸湿性
　　壳聚糖分子中含有氨基、羟基等极性集团，因此具有较强的吸湿性。其吸湿性仅次于甘油，比聚乙二醇三梨醇高。
　　（３）壳聚糖的仿丝性与成膜性
　　将壳聚糖的稀酸溶液喷湿于酮氨液中凝固后经处理可得粘度较好的纤维。将壳聚糖的醋酸溶液涂布于玻板上，干燥后可得到透明膜。
　　（４）壳聚糖的吸收与排泄
　　壳聚糖与植物性食品牛奶、鸡蛋等一起食用可被吸收。植物和细菌中，含有的壳聚糖酶、可将壳聚糖分解为寡聚糖而被吸收。
　　（５）壳聚糖细胞亲和性与安全性
　　壳聚糖的基本单位葡萄糖胺，是体内存在的物质。对人体细胞有良好的亲和性，无排斥反应，无任何副作用。
　　３、壳聚糖的应用前景
　　（１）壳聚糖在保健功能食品上的应用
　　作为保健性功能食品，除满足人们营养上的需要外，应具有A.强化免疫；B.抑制老化；C.预防疾病；D.恢复健康；E.调节生理机能等五大功能。壳聚糖具有如下保健功能：
　　1）对消化系统的保护作用
　　壳聚糖可与胃酸作用成胶状液，附在胃壁上形成保护膜，防止胃酸对胃损伤面的刺激。双歧杆菌在人肠道内可抑制病原菌与***菌的生长；可预防肠道感染造成的功能紊乱，减少有害物质的滞留。壳聚糖对肠内双歧杆菌的生长有促进作用，因而对人体表现出良好的助消化功能。
　　2）降低血脂含量，预防心脑血管疾病
　　壳聚糖携带大量的氨基，是食物纤维素中唯一的阳离子聚合物。可吸附胃肠道中的脂质，阻碍人体对脂肪胆固醇的吸收，从而降低血脂含量、具有抗血栓、预防心脑血管病变的功效，而且达到减肥效果。
　　3）预防高血病
　　目前医学界已确认，高血压是由Cl-引发的。人体摄入食盐后，由于Cl-的存在，增加了末梢血管的收缩力，致使血压增高。带正电荷的壳聚糖能吸附Cl-，因而能起到预防高血压的作用。
　　4）提高机体免疫功能
　　甲壳质能激活免疫系统，促进巨噬细胞的吞噬能力。增强杀伤性T细胞、NK细胞对衰老细胞、病毒感染的靶细胞，及对肿瘤细胞的杀伤活性。由于壳聚糖能与血管内皮细胞结合，而具有一定的抑制癌细胞转移与浸润的能力。
　　（２）在生物医学上的应用
　　1）用做可吸收的外科手术线
　　外科手术时，原有的羊肠线因各种强力问题仍不尽人意。用甲壳质制成的手术线，其相对韧度、伸长率、打结强度、机械强度都显示了较好的适应性。可用常规方法消毒和长期保存，毒性试验表明，它在所有诱变、急性中毒、发热、溶血、皮肤反应方面都显示为阴性，说明无任何毒副作用。
2）用作人工透析膜
　　3）用作抗凝血剂
　　4）用作人工皮肤
　　以甲壳质为原料制成的人工皮肤，具有良好的组织相容性，能加速创面的愈合。用其贴敷各种创面，有消炎、止痛、促进皮肤再生的功效。对创面无刺激性和任何毒性。
　　5）用作药物缓释剂
　　利用壳聚糖或甲壳质等制备长效阿斯匹林，消炎痛、争光雷素、心得安等可将药物释放速度变慢，从而达到减少给药次数，减轻毒副作用等效果。
　　（３）在其它行业的应用
　　1）在化妆品方面的应用
　　壳聚糖具有良好的增粘、保湿、抗静电作用，将壳聚糖参与制成的摩丝涂沫在头发上形成一层薄膜，硬度适中不发粘，无异味，无副作用，易于梳理、定型，光泽美观。
　　2）在纺织、印染、造纸方面的应用。
　　3）在环保方面的应用
　　壳聚糖有良好的吸附性能，可吸附染料、蛋白质、金属离子等。可用于金属富集、回收、分离、污水处理等。应用壳聚糖从工业废水中回收铜已达工业化。目前正研究利用壳聚糖从海水中提取铀。作为絮凝剂，壳聚糖对于活性污泥有很强的絮凝作用，能有效地处理食品工业废水，沉淀废水中的悬浮物。

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如题，透析之后离心得到了澄清的蛋白溶液，为什么浓缩超滤之后蛋白出现我蛋白颜色的沉淀，是因为蛋白浓度太浓了还是缓冲液等其他问题(本人养的蛋白pi值大于9，用的ph7.0的20mM磷酸盐缓冲液)

我有一蛋白,此蛋白共经过两次纯化,第一次凝胶层析,用的是20mmHCl作为洗脱液,第二次纯化用离子交换,初期洗脱液为20mmNaAc(pH6.0),后用含1.5MNaCl的20mmNaAc(pH6.0)梯度洗脱.现欲对其进行脱盐,想选择透析的方法,不知透析液该用哪个呢?考虑到HCl具挥发性,如用20mMHCl冻干后似可以完全脱盐,且第一次纯化时也用此缓冲液洗脱,应对蛋白活性没有太大影响,不知是否可以选择其作为透析的缓冲液呢?还是应选择pH为6.0的PBS作为缓冲液呢?
望达人告知啊~~~
3Q~~~

同时具有疏水和亲水两种基团的化合物，去垢剂能够形成胶束(micelle)，所以非常易于在水中溶解。

去垢剂（离子或非离子表面活性剂）的单体聚集数，这个参数可以从哪儿获取？我想知道sarksol的单体聚集数

如果是蛋白纯化过程中，使用了去垢剂而形成了胶束，比如这个TritonX100单体分子量是628,胶束的单体聚集数是140,所以胶束的分子量有87KD了，透析或超滤皆不可用，该用什么方法除去呢？

各位大神，本人小白一枚，最近做镍柱纯化His标签蛋白，做到透析一步，不知道透析液该怎么配，在此请教大家！

我纯化蛋白时用的缓冲液是50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0，洗脱缓冲液在这基础上加咪唑；

现在纯化后想透析掉咪唑，透析液是直接用结合缓冲液，还是PBS缓冲液，或是Tris-Hcl缓冲液？我考虑用结合缓冲液和PBS缓冲液是因为离子成分相近（都有NaH2PO4和NaCl），盐离子环境的变化不大，但是结合缓冲液的盐离子浓度是不是高了？PBS缓冲液pH一般是7.4，pH从8.0到7.4的变化会影响蛋白质稳定性吗？我看也有好些人用Tris-Hcl缓冲液，我也不知道该怎么选择了，各位大神能否给些建议？谢谢啦！