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新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究
[关键词]细胞因子;凋亡;CKLF1;PDCD5;TFAR19
[摘　要]在人类基因组完成工作框架图以后,人类功能基因组学成为最重要的任务之一。我们目前正在重点研究编码细胞因子和凋亡相关分子的人类功能基因。本综述介绍其中的2个首先由我们实验室克隆的分子,即趋化素样因子1(CKLF1)和程序化细胞死亡分子5(PDCD5,过去命名为TFAR19)。CKLF1是属于一个新的基因超家族的成员,具有体内外对不同白细胞的趋化活性、刺激骨骼肌增殖活性和刺激骨髓细胞增殖活性。在临床应用上,重组CKLF1蛋白质有可能用于肌萎缩的治疗,CKLF1抑制剂有可能用于变态反应和自身免疫病的治疗。PDCD5是凋亡的正调节分子,能够结合胱天蛋白酶23,并在体外延长其半衰期。较多证据表明,PDCD5在肿瘤组织的表达低于正常组织。PDCD5有可能成为肿瘤、自身免疫病的标志或作为一种治疗靶点。
Discoveryandfunctionalclarificationofnovelhumangenesencodingcytokinesandapoptosisrelatedmolecules
KEYWORDS　Cytokine;Apoptosis;CKLF1;PDCD5;TFAR19
SUMMARY　Afterthehumangenomeproject(HGP)wascompleted,oneofthemostimportanttasksistoexplorehumanfunctionalgenomics.Wearenowjustfocusingonthediscoveryandfunctionalclarificationofnovelhumangenesencodingcytokinesandapoptosis2relatedmolecules.Thisreviewwillgiveabriefintroductiontotwoofthemolecules,namelychemokinelikefactor1(CKLF1)andprogrammedcelldeaths5(PDCD5,formerlynamedTFAR19),bothofwhichwerefirstlyclonedfromourlaboratory.TheCKLF1,whichbelongstoanovelgenefamily,haschemotaxiseffectondifferentleukocytesbothinvitroandinvivo.Itcanalsostimulateproliferationofskeletalmusclecellsandbonemarrowcells.TherecombinantCKLF1mayhaveapplicationvalueinthetreatmentofmuscleatrophy,andCKLF1inhibitorscouldbeusedagainstallergyautoimmunediseases.ThePDCD5isapositiveregulatorfortheapoptosis.Itcanbindcaspase23andprolongitshalflifeinvitro.MultipleevidencesindicatethattheexpressionofPDCD5islowerintumortissuesthanthatinnormaltissues.ThePDCD5couldbeusedasamarkortargetforsomeapoptosisrelateddiseases,suchastumorand
autoimmunediseases.
　　人类基因组计划是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程,2001年2月发表了接近完成的人类基因组图谱,标志着人类进入后基因组时代。目
前,摆在我们面前的关键问题是如何开展功能基因组和疾病基因组的研究,如何将人类基因序列转变为人类认识自身的知识,如何对这些基因加以利用,从中寻找出可供开发的宝藏,使之能够造福于人类的健康。这些工作将花费远比基因序列分析更多的时间、更大的投入和更繁重的工作量,也更加具有挑
战性。北京大学人类疾病基因研究中心的一个重要研究方向是开展人类功能基因组学研究,利用生物信息学、分子生物学、细胞生物学及免疫学技术,从人类基因数据库中发掘具有重要生理、病理意义的新基因,为阐明疾病的发病机制、发现基因组药物靶标或基因工程药物候选物提供基础。目前,本中心已经克隆鉴定了至少12个新的未知功能人类基因,全部开展了表达和功能筛选,发现了其中部分具有重要功能意义的基因。此外,本中心与国家人类基因组北方研究中心等单位合作,计划开展400个以上未知功能的人类分泌蛋白和转录因子编码基因的克隆化、表达、活性筛选及功能鉴定的工作,希望能够从中发现一些新的重要功能意义的人类基因。本综述重点介绍我们首次发现的新细胞因子及细胞凋亡相关的人类功能基因。
1　新的细胞因子CKLF家族的克隆、表达和功能研究[1]
1.1　细胞因子概述
细胞因子(cytokine)是由各种免疫细胞和其他系统细胞合成和分泌的小分子多肽类因子,它们调节机体的免疫功能,参与免疫细胞的增殖、分化和行使功能。细胞因子除存在于免疫系统外,在机体的各个系统也广泛存在,发挥极为重要的生理调节作用,某些情况下可产生病理作用。细胞因子主要包括白细胞介素(interleukin,IL)、干扰素(interferon,IFN)、集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、趋化因子(chemokine)、转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGFβ)等,它们在免疫系统中起着非常重要的调控作用,在异常情况下也会导致免疫病理反应。
目前已有十余种细胞因子基因工程药物被批准上市,治疗肿瘤、造血功能障碍、感染性疾病等,近百种正在进行临床试验。因而细胞因子的研究具有重要理论和应用价值。细胞因子中的趋化因子是一组具有趋化作用的细胞因子,能吸引免疫细胞到免疫应答局部,参与免疫调节和免疫病理反应。它们多为小于100个氨基酸的小分子多肽,根据结构可主要分为4个趋化因子亚家族:Cys2X2Cys(CXC)、Cys2Cys(CC)、Cys(C)、Cys2X3、Cys(CX3C)亚家族。趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族,分为CXC受体、CC
受体、C受体和CX3C受体。趋化因子及其受体在炎症、肿瘤、自身免疫病、变态反应、AIDS等过程中发挥重要作用,已有多种趋化因子相关产品进入临床研究,有望为肿瘤和某些炎性疾病的治疗提供新的思路和方法。目前,国际上克隆到的人类趋化因子约有50种,趋化因子受体已近20种。趋化因子
研究已渗透到生命科学的各个领域,发现新的趋化因子并对其进行深入研究将具有重要的理论意义和应用价值。
1.2　CKLF家族的发现和结构特点
目前,新细胞因子克隆的策略往往是利用已知细胞因子序列在基因数据库检索,发现具有同源性的新基因,进而开展表达和功能研究。由于人类基因数据库已经公开,因而这种策略往往容易出现多家实验室竞争的现象。为此,我室韩文玲博士[2]另辟新径,采用了一个新的技术路线:根据人髓性白血病细胞系U937细胞在PHA的刺激下能够产生多种细胞因子,而IL210是一种广谱的细胞因子合成抑制剂的原理,进而推测被IL210所抑制的分子很可能还有其它未被发现的新细胞因子。根据这一设想,利用抑制性减数杂交技术(SSH),以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL210抑制的U937细胞为driver进行减数杂交,研究IL210抑制的U937细胞表达基因,进行EST比较和拼接,得到的
差异表达基因中就可能有新的细胞因子候选基因。通过SSH技术,我们首次成功克隆了一个新的人类细胞因子,经与国际人类基因命名委员会商议,
将其命名为趋化素样因子1(chemokinelikefactor21,CKLF1),并发现其存在至少3种不同的变异体,分别命名为CKLF2,3,4[3]。CKLF1全长CDNA包括530
个碱基,有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。Northernblot分析发现,CKLF1约为0.6kb,其在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL210部分
抑制。CKLF2,3,4分别编码152、67和120个氨基酸,它们与CKLF1有相同的氨基端和羧基端。人类基因组数据库检索发现,CKLF基因位于16号染色体,由4个外显子和3个内含子组成,内含子和外显子交界处序列符合真核细胞剪接规律。CKLF1,2,3,4有共同的外显子1和4,选择性拥有外显子2和3,这进一步证明它们为同一基因的不同剪接形式。CKLFs的表达谱较广,其中CKLF1,2的表达水平较高,CKLF3的表达水平最低。CKLF1蛋白相对分子质量为10.9×103,是高度疏水的碱性蛋白质,有两个连续半胱氨酸的特征性结构,但它与其它CC家族趋化因子之间没有明显同源性;手工排列发现,CKLF1与同样位于16号染
色体上的CC家族趋化因子TARC和STCP21在CC附近有数个关键的氨基酸相同。CKLF1蛋白没有N糖基化位点。SignalP分析发现其没有典型的信号
肽切割位点。CKLFs亚细胞定位和Westernblot分析发现,CKLF1,3为分泌性蛋白,而CKLF2,4则主要以膜结合形式存在。此外,根据人CKLFs的蛋白质和核酸序列,我们利用生物信息学技术成功克隆了大鼠的CKLF1,2,它们分别编码98和151个氨基酸,在GenBank中的登录号为AF253064和AF253065;小鼠的CKLF2,
4,编码152和120个氨基酸,在GenBank中的登录号为AY047360和AY046597。大鼠和小鼠CKLF2与人CKLF2在蛋白质水平上的同源性分别为62%和59%,这表明CKLFs在进化过程中比较活跃,可能起比较精细的调节作用。大鼠CKLF1,2和小鼠CKLF2,4与人CKLFs的剪切形式完全相同,但它们的特征性结构是CX3C,而不是CC;另外,人CKLFs的表达谱较广,而大鼠和小鼠的CKLFs则在睾丸组织中特异性高表达(待发表资料)。
1.3　CKLF的生理和病理功能
为了研究CKLFs的生物学活性,我们构建了真核表达载体pcDI2CKLF1和pcDI2CKLF2,转染COS27细胞,用微孔穿膜法对转染细胞上清液进行趋化活性分析,发现CKLF1对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性[3]。同时,将pcDI2、CKLF1裸质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中,研究其体内活性。注射质粒10d后,取注射部位肌肉组织,切片,染色。与空载体对照组相比,pcDI2CKLF1
组小鼠肌肉切片中有明显的细胞浸润增多现象。特殊染色和形态学观察发现CKLF1在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞,与体外趋化结
果一致。CKLF1除了引起注射局部细胞浸润增多外,还引起骨骼肌细胞核居中排列等肌肉组织再生现象,促进骨骼肌原代肌卫星细胞和造血干/祖细胞
的增殖,促进人骨髓细胞集落形成[4]。此外,pcDI2、CKLF1注射小鼠肺部炎性病变明显,支气管变形,管腔内有脱落的上皮和渗出物,肺组织充血水肿,炎细
胞浸润,与哮喘发病后期的病理改变非常相似[5]。pcDI2CKLF1注射组雄性小鼠睾丸组织改变明显,表现为生精细胞减少。CKLF1转基因小鼠的肺部病变
也非常明显,表现为肺组织内炎细胞聚集,肺泡隔增厚、充血、水肿,与注射CKLF1真核表达质粒小鼠的肺部改变十分相似;而睾丸内生精细胞减少,雄性小
鼠不育,其它器官的改变不明显,与CKLF1在成年小鼠体内高表达后引起的改变相似(潘秀芳等,待发表资料)。目前,尚没有一种因子能引起如此明显的
病理改变,这提示CKLF1在呼吸系统炎症性疾病的发病过程中起重要作用,将来有可能以CKLF为靶标,设计抗呼吸系统炎症性疾病的新药。
CKLF2是CKLF1的全基因产物,其趋化作用很弱,但骨骼肌刺激活性较强。稳定表达CKLF2的小鼠肌母细胞系C2C12增殖明显加速,倍增时间缩短;CKLF2除了具有促C2C12细胞增殖活性外,还能促进C2C12细胞分化,在高血清培养条件下,CKLF2/C2C12细胞融合加速,肌管增多;同时,肌细胞分化的特异性分子肌球蛋白重链(myosinheavychain,MHC)和生肌素(myogenin)的表达水平明显增加。CKLF2既能促进骨骼肌细胞增殖,又能促进其分化,与胰岛素样生长因子21(Insulin2likegrowthfactor1,IGF21)的作用类似[6]。人、大鼠CKLF1和CKLF2的真核细胞转染细胞上清液能够促进大鼠原代肌卫星细胞的增殖[7]。对小鼠和大鼠CKLF的功能研究发现,大鼠CKLF1与人CKLF1相似,对嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性,并且能与人CCR4结合;而CKLF2的趋化活性不明显(待发表资料)。小鼠CKLF2与人CKLF2相似,同样能促进C2C12细胞的增殖和分化。小鼠原代肌卫星细胞诱导分化后,mCKLF2的表达水平明显增高,其变化与肌细胞分化特异性分子肌球蛋白轻链(myosinlightchain,
MLC)和肌酸激酶(myosincreatinekinase,MCK)的变化一致。这进一步证明CKLF2在骨骼肌的分化发育过程中起重要的作用。综上所述,我们成功克隆了一个新的有重要功能的CKLF家族,CKLF1在体内外具有广谱的趋化活性,在体内具有促进骨骼肌再生和肺部炎症性病变的效应;CKLF2能够促进细胞增殖、分化,抑制细胞凋亡,提示CKLF在机体的生理和病理调节中具有重要意义。CKLF家族在临床的应用价值可能包括:重组CKLF蛋白或基因对骨骼肌萎缩性疾病的治疗效应,CKLF抑制剂(如中和抗体或可溶性受体)在变态反应和自身免疫性疾病的治疗作用等。
2　新的人类凋亡相关基因PDCD5(TFAR19)的克隆、表达和功能研究
2.1　凋亡概述
凋亡(或程序性细胞死亡)是一个生理性的细胞自我毁灭的过程,在胚胎发育、生物体内环境的稳定及多细胞生物防御外在及内在伤害方面均起着非常
重要的作用。凋亡过程的紊乱,可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变如Alzheimer病及局部损伤等。凋
亡细胞表现出一些共同的特征,如形态学的改变(包括胞膜小泡的形成,细胞的皱缩,凋亡小体的形成),生物化学特性的改变(如胞膜内环磷脂酰丝氨酸的
外翻,DNA的片段化,细胞骨架的解离,细胞内功能蛋白的降解等)。目前人们了解得较多的两条凋亡通路包括死亡受体诱导途径和线粒体诱导途径,胱
天蛋白酶(caspases)分子贯穿了这两条通路的始终。凋亡分子的研究具有重要的理论研究意义和实用价值,针对凋亡分子设计的药物已经在临床用于肿瘤等疾病的治疗。
2.2　PDCD5(TFAR19)的发现和结构特点
TF21细胞是一种依赖细胞因子生长的人红白血病细胞系,必须在细胞因子(如IL23或GM2CSF)存在的条件下才能生长,一旦撤除细胞因子,TF21细胞进入凋亡阶段。为发现凋亡高表达的基因,本实验室刘红涛博士[8]利用cDNA2RDA(cDNArepre2sentationaldifferencesanalysis)技术,以正常培养的TF21细胞为Driver,以撤除GM2CSF8h诱导凋亡的TF21细胞为Tester,克隆了2个凋亡高表达的新基因,命名为TFAR15(TF21cellapoptosisrelatedgene15)[9]和TFAR19[10]。后经国际人类基因命名委员会建议,分别命名为PDCD10(ProgrammedCellDeath
10)和PDCD5。其中PDCD5定位于染色体19q122q13.1,由6个外显子和5个内含子组成,全长基因约有6Kb,cDNA全长为559个碱基,包括polyA和AATAA加尾信号,由6个外显子构成,第25～399位碱基读码框架编码125个氨基酸的蛋白质,计算机分析及WesternBlot均证实其相对分子质量为14×104,等电点为5.65。PDCD5的mRNA在50种人类组织中均有表达,其中胚胎组织表达明显低于成年
组织。PDCD5在种属进化过程中是高度保守的基因,并且随着种属从低等到高等的进化,同源性不断增加。如酵母的YMR074C基因与PDCD5在核苷酸水平上的同源性只有32%,果蝇、小鼠的Pdcd5与人的在核苷酸水平上有57%和81%的同源[11,12],而小鼠的Pdcd5与人的在蛋白质水平上的同源性高达
96%。PDCD5基因的进化保守性提示它是具有重要生物学功能的基因。
2.3　PDCD5(TFAR19)的功能特点
PDCD5经过真核表达载体导入或大肠杆菌表达重组蛋白导入多种细胞后,单独不能对细胞产生明显的影响,但加入诱导凋亡的因素如撤除细胞因子、撤除血清、化疗药物处理、抗FAS抗体处理、射线照射等,均可明显促进其凋亡。这些结果表明PDCD5是凋亡促进剂,而不是凋亡诱导剂[10,13～16]。进一步研究表明,PDCD5的反义寡核苷酸可以部分抑制VP16诱导的Jurkat细胞的凋亡,并能部分抑制胱天蛋白酶23的活性,ELISA试验证实PDCD5可以结合活化胱天蛋白酶23,并且纯化的PDCD5重蛋白可以明显延长活化的胱天蛋白酶23的体外半衰期,提示PDCD5可能作为胱天蛋白酶23的正调控分子参与细胞凋亡(待发表资料)。为进一步研究PDCD5的功能,我们制备了抗PDCD5的单克隆抗体[17],将抗PDCD5单克隆抗体利用电脉冲导入细胞,可以明显抑制细胞的凋亡[18]。反义封闭和抗体封闭实验均表明内源性的PDCD5在细胞凋亡过程
中发挥重要的正调控效应。在研究PDCD5在细胞内的表达和分布时,我们利用FITC标记抗PDCD5抗体,在荧光显微镜观察PDCD5荧光强度,结果意外发现,PDCD5蛋白在凋亡过程中不仅表达增加,而且在凋亡的早期出现明显的核转位现象,其出现的时间早于AnnexinV检测的PS外翻现象,因而有可能作为一种新的早期凋亡的标志[19,20]。上述结果充分提示PDCD5是一个重要的凋亡正调控分子。但是PDCD5通过何种方式调节了胱天蛋白酶23的活性,细胞内还有哪些分子和PDCD5结合共同调控细胞的凋亡,尚需要进一步的研究。
2.4　PDCD5(TFAR19)的临床意义
目前,国内外已有多家实验室利用不同技术发现PDCD5在疾病情况下,特别是在肿瘤的表达明显下降。例如,国家人类基因组南方研究中心的XU等[21]利用DNA芯片技术研究肝癌的差异表达基因,发现一些细胞凋亡相关基因如PDCD5,PDCD8,Bak,TRAF6和TRAIL等在肝癌中表达明显下降。Hedenfalk等[22]利用DNA芯片技术分析遗传性乳腺癌组织的基因表达谱,发现BRCA12突变肿
瘤中PDCD5表达增加,而BRCA22突变肿瘤中PDCD5表达减少。Yale大学医学院Halaban利用DNA芯片技术发现,与正常黑色素细胞比较,PDCD5mR2NA在多种黑色素瘤细胞的表达降低数倍(个人通讯)。北京大学人民医院阮国瑞等[23]利用15种不同荧光标记的单克隆抗体,将骨髓细胞分成不同的群体,通过流式细胞术检测未治CML慢性期病人、CML加速/急变期病人及正常人骨髓不同群细胞内PDCD5(TFAR19)的表达。结果发现,未治CML慢性期及加速/急变期病人骨髓总的有核细胞、粒细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于正常人组骨髓总的有核细胞;加速/急变期病人骨髓总的有核细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于未治CML慢性期及正常人骨髓的。这些结果说明PDCD5的异常表达
可能在CML疾病进展中起一定作用。为进一步了解PDCD5与临床疾病的关联,本中心已经与40余个实验室开展了合作研究,希望了解PDCD5与肿瘤、心血管疾病、自身免疫病、神经系统疾病等的关联,目前已有5个项目获得预实验的阳性结果,正式立项开展研究,其中包括慢性髓性白血病、银屑病、心力衰竭、老年性痴呆、系统性红斑狼疮等(参见本中心网址:http://gene.bjmu.edu.cn/research.htm#1)。
综上所述,PDCD5是由本室克隆的新的凋亡促进因子,其异常表达与肿瘤、自身免疫病等疾病相关,可能参与这些疾病的异常凋亡过程。PDCD5有可能成为上述疾病的辅助诊断标志或治疗靶点。
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摘要： 所谓细胞因子是指由免疫细胞(单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞)等经刺激而合成、分泌的一类具有多种生物学活性多肽或蛋白质。
所谓细胞因子是指由免疫细胞(单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞)等经刺激而合成、分泌的一类具有多种生物学活性多肽或蛋白质。这些细胞因子分为几个大的家族，临床上常用的可以用于肿瘤治疗领域的有白细胞介素类(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子和各种细胞生长因子等。从治疗目的讲，这些细胞因子可以用于血液肿瘤如白血病、淋巴瘤的治疗以及一些实体肿瘤的治疗，如恶性黑色素瘤、肾癌等。从辅助治疗角度来讲，这些细胞因子可以用于治疗由于化疗、放疗而造成的一些不良反应、并发症的治疗。例如，患者在接受化疗时往往会造成造血抑制，通过应用一些造血刺激因子可以加速患者的造血功能恢复，尽快脱离危险并进入下一周期的治疗

我的细胞复苏的时候染菌了，还能不能用来测胞内细胞因子IFN-γ，谢谢大家，帮帮忙。

在血液病临床上常用的细胞因子有：干扰素、白细胞介素、促红细胞生成素、集落刺激因子等。干扰素（IFN ）具有抗病毒、抑制细胞增殖及免疫调节功能。出IFNa 应用于慢性粒细胞白血病的治疗能有效地控制症状，取得血液学和细胞遗传学的缓解，对其他骨髓增殖性疾病如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化也有较好的疗效。a 干扰素作为毛细胞白血病的首选药物，对切脾及其他治疗无效者均有疗效，且毒副作用小。应用于其他慢性淋巴增殖性疾病，如慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤，可使部分患者取得疗效。同时，干扰素还可应用于血小板减少性紫瘫、再生障碍性贫血、MDS 等疾病。 白细胞介素是由淋巴细胞或单核细胞分泌的一系列具有免疫活性的糖蛋白。其中IL 一2 是临床上应用较为广泛的一种。它能促进T 细胞增殖与分化，增强NK 细胞的活性，提高单核一巨噬细胞的细胞毒作用。经IL 一2 激活的杀伤细胞（LAK ）具有广泛的抗肿瘤活性。由MHC 递呈肿瘤特异抗原和IL 一2 共同作用下激活的肿瘤浸润淋巴细胞具有特异肿瘤杀伤活性。IL 一2 应用于白血病及其他恶性血液病化疗及骨髓移植后，可有效地杀灭体内残存的肿瘤细胞，延长缓解期及生存期。LAK 细胞还可用于自身移植的体外净化。 集落刺激因子包括粒系集落刺激因子（G 一CSF ）、粒单巨噬系集落刺激因子（GM - CSF ）及单核巨噬系刺激因子（M 一CSF ）。是由T 细胞、内皮细胞及成纤维细胞等在抗原炎症等刺激下产生的。主要生物活性是促进粒单系造血细胞增殖分化，并增强粒单系细胞的功能，提高防御能力。 G 一CSF 或GM 一CsF 应用于白血病化疗后，可明显缩短中性粒细胞缺乏的时间，减少感染的机会及抗生素的用量，并无明显刺激白血病细胞的再生长。应用于自体或异基因骨髓移植后，可加速造血重建，减少感染及住院时间。与丙种球蛋白等应用于重型再障，可促进造血细胞生长，降低感染。治疗MDS 可促进中性粒细胞的上升。 促红细胞生成素（EPO ) ，由肾小管周围微血管内皮细胞产生，肾脏氧合作用调节的一种糖蛋白，具有调节红细胞增殖分化成熟的功能，主要作用于红系祖细胞（CF ' U 一E ）。应用于肾性贫血、再生障碍性贫血、MDS 及多发性骨髓瘤均有一定的疗效。也有报道对淋巴细胞增殖性疾病也有良效。

喹诺酮类药物作用的靶酶为细菌的DNA回旋酶（gyrase）及拓扑异构酶Ⅳ。对大多数革兰阴性细菌，DNA回旋酶是喹诺酮类药物的主要靶酶，
而对于大多数革兰阳性细菌，喹诺酮类药物主要抑制细菌的拓扑异构酶Ⅳ，拓扑异构酶Ⅳ为解链酶，可在DNA复制时将缠绕的子代染色体释放。向左转|向右转

本人在做与牙周炎相关的临床试验，采集了龈沟液，想用ELISA检测其中IL-β和TNF-α的浓度，但不知道买哪家公司的试剂盒，请问有经验的高手有没有推荐的？？？？国产和进口差别大吗？？如果样本不足20个，购买48孔板够用吗？？？情况紧急，坐等大家回复！谢谢！

RT，有人添加b27，有人不加，这是为什么？应该以什么为标准呢？

EGF用0.1%BSA稀释后加入培养液是否违法无血清的原则？

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞，表皮细胞和成纤维细胞等)经刺激而合成分泌的一类小分子量可溶性蛋白或蛋白多肽。
细胞因子的种类：
白细胞介素(ILS)干扰素(IFN)肿瘤坏死因子(TNF)集落刺激因子(CSF)趋化因子(chemokines)生长因子(GF)
细胞因子的主要生物学作用：
① 抗感染和抗肿瘤作用。②免疫调节作用。③参与细胞凋亡。④刺激造血细胞增殖，分化。⑤促进各种细胞的生长和分化⑥参与和调节炎症反应。⑦细胞因子异常可导致疾病的发生。⑧参与神经-内分泌-免疫网络。

干细胞因子及其受体介导的细胞内信号转导

«生命的化学»2001年21卷1期

熊安琪陈松森
(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005)

关键词：干细胞因子；c-Kit受体；细胞内信号转导
中图分类号：Q507

干细胞因子(stemcellfactor,SCF)是一种重要的造血因子，对正常造血细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞的增殖和分化以及肿瘤细胞的增殖和恶性演进等起着重要的调节作用。其受体是由原癌基因c-kit编码的一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白c-Kit，分子量为117~145kD[1]。c-Kit受体由胞外结构域、单一的短跨膜区和胞内结构域三部分组成。SCF与c-Kit之间的特异性结合可触发c-Kit的同源二聚体化和其细胞膜内酪氨酸残基的磷酸化，产生停泊位点，捕获含有SH2结构域的信号分子、还能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Rac1、JNK、Raf-1、JAK2等，通过多种信号因子的参与将细胞外的信号转导到细胞内部，引发某些基因的特异性表达。越来越多的研究表明：SCF/c-Kit下游的信号转录情况是非常复杂的，它是各种底物激酶的酪氨酸磷酸化和丝/苏氨酸激酶磷酸化的共同参与和整合，并且存在着许多信号转导途径之间的串话作用(cross-talking)，从而精确地调控细胞的分化和增殖，其具体机制是近年来信号转导研究中的热点问题。本文对SCF/c-Kit介导的细胞内信号转导途径的研究进展作一综述(图1)。

图1SCF激活多种信号转导途径示意图(引自DianaLinnekin,1999)[2]

1.Jak/STAT信号转导途径

Jak激酶是一种非跨膜酪氨酸激酶，可以与细胞因子受体胞内区偶联，在细胞因子与受体结合后能被迅速活化，激活信号蛋白STATs，使之进核，并诱导目的基因的表达。JAK激酶家族共有4个成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。研究表明SCF可以诱导JAK2与c-Kit偶联，激活JAK2，诱导最大的细胞增殖反应。而JAK2缺陷型小鼠在子宫中死亡的胚胎发育阶段与c-Kit或SCF缺陷型小鼠相一致，进一步证明JAK2对SCF诱导的正常造血细胞的增殖、分化具有重要的影响[3]。STAT分子除了通过JAK激酶被激活外，还可以被c-Kit受体直接激活。当SCF刺激表面表达有c-Kit受体的骨髓细胞和成纤维细胞时，c-Kit胞内的不同结构域分别诱导STAT1α、STAT5A和STAT5B与之发生偶联磷酸化，而其他的STAT蛋白在SCF刺激下不能被募集活化。其中STAT1α以同源二聚体形式与c-Sis可诱导DNA元件(SIE)结合，STAT5蛋白以STAT5A/STAT5B或STAT5/STAT1α异源二聚体形式与β-酪蛋白启动子的催乳素诱导元件结合。实验研究还表明缺失激酶插入区的c-Kit缺失突变体不能激活STAT信号转导，进一步证实了c-Kit受体酪氨酸激酶活性对STAT激活的重要性[4]。

2.PI3K途径

SCF等细胞因子在刺激某些靶细胞时，可以通过c-Kit直接快速激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，也能通过Shc、Rac、Ras和Rho激酶激活或增加PI3K的活性。PI3K是一种由调控亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体，属多基因家族。在造血细胞中有3种p110的异构体(α、β、δ)表达，其中δ只在造血细胞中表达。当SCF与c-Kit结合时，c-Kit受体酪氨酸激酶磷酸化，在其激酶插入区第719位酪氨酸处于PI3K的p85亚基结合，使之磷酸化，激活p110催化亚基。大量的研究发现，当c-Kit第719位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)时，既失去了与PI3Kp85亚基偶联的能力，又丧失了SCF介导的使PI3K活性增加的能力，但Y719Fc-Kit自动磷酸化的活性没有损伤[5]。激活的PI3K又能激活下游的信号分子p70核糖体S6激酶(p70ribosomalS6kinase,p70S6K)、蛋白激酶B(PKB也叫Akt)和NF-κB[6]。Hunter等人通过构建c-KitTyr719→Phe突变的纯合体小鼠，完全阻断了c-Kit介导的PI3K信号转导途径，并且使Akt活性降低了90%。虽然该型小鼠在造血作用和黑色素生成中未表现出缺陷，但随着精原干细胞增殖减少和随后精原细胞凋亡增加，雄性小鼠精子细胞生成受阻导致不育，而该型的雌性小鼠生殖功能正常[7]。提示SCF/c-Kit信号转导途径在精子生成的生理和病理过程中起着非常重要的作用。

3.Src家族激酶

目前已发现的酪氨酸蛋白激酶Src家族的成员有：Src、Yes、Fgr、Fyn、Lck、Lyn、Blk和Hck。研究发现对SCF反应的细胞系和正常的祖细胞中都存在Lyn的高表达。用GST融合蛋白进行体外研究证明：Lyn通过SH2结构域与人c-Kit的近膜区序列568Y*VY*磷酸化酪氨酸特异性偶联磷酸化，并使其激酶活性增加，在SCF介导的细胞增殖中发挥作用。另外，Fyn也能结合相当于人c-Kit568Y*VY*磷酸化酪氨酸的多肽序列。

一种广泛表达的酪氨酸激酶Csk和与其有相似酶活性的激酶CHK(Cskhomologouskinase)可以通过磷酸化Src家族成员高度保守的C-末端酪氨酸残基而下调其活性，但对c-Kit自动磷酸化却没有明显的作用。CHK在巨核细胞、自然杀伤细胞和脑中组成型表达，SCF能够诱导CHK表达，但对Csk的表达没有影响。磷酸多肽研究提示CHK与人c-Kit第568和570位磷酸化酪氨酸发生偶联，而该位点也能与Lyn和Fyn偶联，这可能是下调SCF/c-Kit激酶活性的一种机制[8]。

另外，最新的研究发现Src家族激酶还在SCF诱导的c-Kit运输中发挥作用。正常情况下，当c-Kit与SCF结合后，该复合物快速内化，以减少细胞对SCF的反应。这种内化以及细胞受体的运输可能还是全面激活与受体偶联的信号转导通路所必需的。而Src家族激酶抑制剂PP1可以阻断SCF诱导的造血细胞表面受体c-Kit的成帽和c-Kit的内化，而c-Kit仍能与网格蛋白偶联，说明c-Kit在进入网络蛋白包被小凹过种中不依赖于Src家族激酶的作用[9]。具体的作用机制还不清楚，尚需进一步的研究。

4.Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径

在SCF与c-Kit结合而诱导的增殖反应中，Ras蛋白的激活是其中的一个重要环节。由SCF介导的c-Kit受体自动磷酸化能捕获多种含有SH2结构的信号分子与受体形成复合物，其中含SH2蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)和Shc的酪氨酸残基首先被磷酸化，然后偶联Grb2和Grap。Grb家族成员又与一种鸟苷转换因子Sos偶联，使Sos和Ras共定位，从而增加Ras的活性。SCF还能诱导含有SH2结构域的磷酸化酪氨酸蛋白SHIP与Shc偶联。SHIP具有5磷酸酶活性，是一种造血的负调控因子。研究还发现一种GTPase激活蛋白核因子(NF1)也参与调节SCF激活的Ras活性。

许多实验室的研究证明Raf-1这种丝/苏氨酸激酶也参与了SCF引发的磷酸酪氨酸激酶信号转导事件，在SCF的作用下其活性明显增加。SCF还能增加MEK1、MEK2和MAPK的酪氨酸磷酸化和激酶活性，再依次磷酸化并激活ERK1和ERK2[10]，最后激活转录因子从而激活相应的基因，提供了一条由SCF诱导c-Kit激活引发的“级联”效应信号转导途径：Ras→Raf→MEK→ERK→其它激酶或转录因子，并且该途径的激活可以通过多种机制进行调节。

5.SCF信号转导中的负调控因子

SHP1是一种广泛表达在造血细胞内的酪氨酸磷酸酶(PTPase)，对多种生长因子和细胞因子引发的有丝分裂信号进行负调控，尤其是在调节造血细胞的生长和发育过程中起着关键的作用。研究表明c-Kit与SCF结合后与SHP-1偶联发生了去磷酸化的细胞内反应[11]。鼠c-Kit受体近膜区磷酸化的569位酪氨酸是SHP-1选择性结合的主要位点，567位酪氨酸也可与之结合。对真性红细胞增多症的病因研究发现：真性红细胞增多症患者的红系祖细胞尽管在细胞因子的量和与受体的亲和力都没有增加的情况下，对几种生长因子的促有丝分裂作用却高度敏感。实验表明，近60%的患者在红细胞克隆形成单位中SHP1的表达减弱[12]。

另一种蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2也能负调控c-Kit介导的信号转导。SCF刺激使SHP2通过567位磷酸化酪氨酸残基与c-Kit受体偶联。分别将转染的小鼠pro-B细胞系Ba/F3中c-Kit受体的567和569位酪氨酸突变为苯丙氨酸，SHP1和SHP2与c-Kit的偶联能力都显示降，细胞在SHP的作用下出现过度增殖[11]。研究表明SHPO2对红系和髓系细胞的发育具有重要的作用，它在早期造血过程中是一种正向调控因子，在进一步分化的细胞中是一种负调控因子[13]。

蛋白激酶C(PKC)也能负调控SCF介导的细胞增殖。PKC在体内和体外均可磷酸化c-Kit第741位和746位丝氨酸，突变这两个位点既提高了c-Kit的激酶活性，又促进了PI3K与c-Kit受体的偶联，从而使SCF介导的细胞增殖增加，同时降低了细胞的运动性。研究发现PKC介导的c-Kit受体丝氨酸磷酸化降低了捕获含有SH2结构域的信号分子与c-Kit偶联的能力，但不影响SCF诱导的Raf-1和ERK2的激活。

6.小结

近年来的研究证明SCF/c-Kit能够激活多种信号转导途径，而且由于许多信号分子的细胞特异性，决定了细胞内环境的复杂性和特异性，也决定了不同的生物学结果(细胞的存在、分化、增殖或凋亡)。尤其是c-Kit受体在造血系统中不同细胞系之间和不同分化阶段之间分布的差异，以及SCF与其它生长因子的协调作用，使得该信号转导途径更为复杂。这方面的研究对于我们认识各种生长因子对静止干细胞的协同作用和造血过程的一些基本问题，为从阻断或激活某些信号转导途径入手设计新型药物，具有重要理论意义和广阔的应用价值。

参考文献

[1]YardenYetal.EMBOJ,1987,6:3341-3351
[2]DianaLinnekin.TheIntJBioch&CellBiol,1999,31:1053-1074
[3]ParganasEetal.Cell,1998,93:385
[4]MariaFBetal.JBiolChem,1999,274(24):16965-16972
[5]DuronioVetal.CellSignal,1998,10:233-239
[6]DownwardJetal.CurrOpinCellBiol,1998,10:262-267
[7]Blume-JensenPetal.NatGenet,2000,24(2):157-162
[8]PriceDJetal.BiochemBiophysResCommun,1999,259(3):611-616
[9]VirginiaCetal.Blood,1999,94(6):1979-1986
[10]SuiXetal.Blood,1998,92:1142
[11]KozlowskiMetal.MolCelBiol,1998,18:2089-2099
[12]WickremaAetal.ExpHematol,1999,27(7):1124-1132
[13]QuCKetal.MolCelBiol,1998,18:6075

最近接到几例病例，均说是在美容院注射生长因子，一个人还把注射药拍了照片，是什么人体生长因子，两个月后...

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