SampleTyple | Plasma,Serum,Cellculturesupernatant,otherbodyfluid | |||||||
Components | ||||||||
Method | Colorimetricmethodat570nm | |||||||
StandardCurve | ||||||||
Sensitivity | 4µM-200µM | |||||||
ReactionTime | 30minutes | |||||||
Applications | ForBIOLOGicalresearch: | |||||||
Storage | -80°C | |||||||
| Notes | Materialneededbutnotsupplied Aplatereadercapableofmeasuringabsorbanceat570nm AdjustablePipettesandarepeatpipettor Distilledwater(milliQorHPLC-grade) ClearFlatbottom96-wellplatesifnotincludedinthekitpurchased | |||||||
| Shipping | Icepacks | |||||||
ReagentPreparation Note:Allreagentsarefrozen.Werecommendyouspinsmallvialsbeforeopening. 1.GlucoseAssayBuffer(10x) Note:Pleasedon’tdodilutionintheprovidedGlucoseAssayBufferbottleitself. Thebottlecontains10mlof10xGlucoseAssayBuffer.Theassaybuffermustbeequilibratedtoroomtemperature.Pleasemakeappropriateamountof1xGlucoseAssayBufferfortheassay,forexample,bydiluting1mlof10xGlucoseAssayBufferwith9mlofdistilledwater.Prepareadditionaldilutedassaybufferifneeded.Storeat-80?C. 2.GlucoseStandard(10x) Note:Pleasedon’tdodilutionintheprovidedGlucoseStandardvialitself. Thevialcontains100µlof2mMGlucoseStandard.Thestandardmustbeequilibratedtoroomtemperaturebeforeuse.Dilute100µlof2mMGlucoseStandardwith900µlofdilutedGlucoseAssayBuffertopreparea200μMGlucoseStandard.1mlofdilutedGlucoseStandardisenoughformaking3standardcurvesifassayedinduplicate.Storeat-80?C. 3.AssayProbe Thevialcontains45μlofAssayProbe.Theassayprobemustbeequilibratedtoroomtemperaturebeforeuse.Itissufficientfor100wells.Protectfromlight.Storeat-80?C. 4.GlucoseEnzymeMix Thevialcontains70μlofGlucoseEnzymeMix.Theenzymemixmustbethawedonicebeforeuse.Itissufficientfor100wells.Storeat-80?C. | ||||||||
Protocol 1.SamplePreparation Blood(serum/plasma),urine,otherbodyfluidscanbemeasureddirectlybyaseriesofdilutionsofthesample(1/2;1/4;1/8;…)toensurethereADIngsarewithinthestandardcurverange.YoursamplescanbedilutedwithdH2OordilutedGlucoseAssayBuffer. Note: | ||||||||
2.StandardCurvePrepation Add50μl,40μl,30μl,20μl,10μl,5μl,1μl,and0μlofdilutedGlucoseStandardtoeachwell,thenadjustvolumeto50μl/wellwithdilutedGlucoseAssayBuffer. | ||||||||
3.ReactionSolutionPreparation 12µlGlucoseAssayEnzymeMix 8µlAssayProbe 1mlofReactionSolutionisenoughfor~20wells. PrepareappropriateamountofReactionSolutionforthenumberofassaystobeperformed. Note:PleasedonotkeepanyleftoverReactionSolutionasithastobemadefreshrightbeforeyourunassays.IfoldReactionSolutionisused,assayswillnotwork. | ||||||||
4.Performtheassay a.Mixthereactionsolutionwellandadd50μlofthereactionsolutiontoeachwellcontainingtheGlucosestandardsandtestsamples. | ||||||||
5.Calculation a.AveragetheOD570nmvaluesofreplicatewellsofeachGlucoseStandard,testsamples,andblank.Then,correctbackgroundbysubtractingthevaluederivedfromtheblankfromallsamplereadings. Glucose(μM)=[(Correctedabsorbance)-(y-intercept)]/Slope | ||||||||
GlucoseAssayBuffer | GlucoseAssayEnzymeMix | |||||||
Components | CAS# | Components | CAS# | |||||
PotassiumPhosphateMonobasic | 7778-77-0 | PotassiumPhosphateMonobasic | 7778-77-0 | |||||
PotassiumPhosphateDibasic | 7758-11-4 | PotassiumPhosphateDibasic | 7758-11-4 | |||||
Water | 7732-18-5 | GlucoseOxidase | 9001-37-0 | |||||
GlucoseStandard | AssayProbe | |||||||
Components | CAS# | Components | CAS# | |||||
SodiumD-Glucose | 50-99-7 | DMSO | 67-68-5 | |||||
PotassiumPhosphateMonobasic | 7778-77-0 | |||||||
PotassiumPhosphateDibasic | 7758-11-4 | |||||||
Water | 7732-18-5 | |||||||
EyeProtection | Wearsafetygoggles |
SkinProtection | Wearprotectiveclothing |
HandProtection | Wearprotectivegloves |
Respiratoryprotection | WearNIOSH/MSHAapprovedrespirators |
9.PHYSICALANDCHEMICALPROPERTIES
9.1Informationonbasicphysicalandchemicalproperties
GlucoseAssayBuffer
Appearance | Liquid,colorless |
pH | 7.0 |
Meltingpoint | Nodataavailable |
Freezingpoint | Nodataavailable |
Boilingpoint | Nodataavailable |
Density | Nodataavailable |
Watersolubility | Soluble |
GlucoseStandard
Appearance | Liquid,colorless |
pH | 7.0 |
Meltingpoint | Nodataavailable |
Freezingpoint | Nodataavailable |
Boilingpoint | Nodataavailable |
Density | Nodataavailable |
Watersolubility | Soluble |
GlucoseAssayEnzymeMix
Appearance | Liquid,yellow |
pH | Nodataavailable |
Meltingpoint | Nodataavailable |
Freezingpoint | Nodataavailable |
Boilingpoint | Nodataavailable |
Density | Nodataavailable |
Watersolubility | Soluble |
AssayProbe
Appearance | Liquid,colorless |
pH | Nodataavailable |
Meltingpoint | Nodataavailable |
Freezingpoint | Nodataavailable |
Boilingpoint | Nodataavailable |
Density | Nodataavailable |
Watersolubility | Soluble |
9.2Othersafetyinformation
Nodataavailable.
10.STABILITYANDREACTIVITY
10.1Reactivity
Nodataavailable
10.2Chemicalstability
Stableunderrecommendedstorageconditions.
10.3Possibilityofhazardousreactions
Nodataavailable.
10.4Conditionstoavoid
Nodataavailable
10.5IncompatIBLematerials
Strongoxidizingagents
10.6Hazardousdecompositionproducts
Hazardousdecompositionproductsformedunderfireconditions:carbonoxides
11.TOXICOLOGICALINFORMATION
11.1Informationontoxicologicaleffects
Toxicologicaleffectsonthisproducthavenotbeenthoroughlystudied.
12.ECOLOGICALINFORMATION
12.1Toxicity
Avoidreleaseintoenvironment
12.2Persistenceanddegradability
Nodataavailable
12.3.Bioaccumulativepotential
Nodataavailable
12.4Mobilityinsoil
Nodataavailable
12.5ResultsofPBTandvPvBassessment
Nodataavailable
12.6Otheradverseeffects
Nodataavailable
13.DISPOSALINFORMATION
13.1Wastetreatmentmethods
Disposeinaccordancewithlocal,state,andfederalregulations.
14.TRANSPORTINFORMATION
DOT:
Propershippingname:none
Non-Hazardousfortransport:thissubstanceisconsideredtobenon-hazardousfortransport
IATA:
Propershippingname:none
Non-Hazardousfortransport:thissubstanceisconsideredtobenon-hazardousfortransport
ADR/RID
Propershippingname:none
Non-Hazardousfortransport:thissubstanceisconsideredtobenon-hazardousfortransport
15.REGULATORYINFORMATION
EURiskandSafetyphrases:
R36/37/38:irritatingtoeyes/respiratorysystem/skin
16.OTHERINFORMATION
Theinformationaboveisbelievedtobeaccurateandrepresentsthebestinformationcurrentlyavailabletous.However,wemakenowarrantyofmerchantabilityoranyotherwarranty,expressorimplied,withrespecttosuchinformation.EtonBioscienceInc.shallnotbeheldliableforanydamagesorotherconsequencesresultingfromhandlingorfromcontactwiththeaboveproduct.ebiomall.com
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我用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒（E2920）检测到的firefly萤光素酶活性很低，只有4*10的3次方；海肾萤光素酶活性有10的6次方。
我用Ad293细胞做了转染，fireflyluciferase质粒：RanillaLuciferase质粒=0.1ug：0.025ug/一个孔（96孔板），共转染了二天，再进行双萤光素酶检测。
我想了解fireflyluciferase活性用promega的这个E2920-双萤光素酶试剂盒检测得到10的3次方，这种数值正常吗？
我做了3次重复实验，每次firefly萤光素酶活性很低，只有4*10的3次方；而海肾萤光素酶活性有10的6次方。
求指教？fireflyluciferase活性低？会是什么原因呢？
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ldh试剂盒指乳酸脱氢酶检测试剂盒，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。
ctl毒性杀伤检测试剂盒是基于LDH在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤。
牛胰岛素,是一种多肽
在1965年9月17日我国完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定，它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都和天然的牛胰岛素完全一样。这是世界上第一个人工合成的蛋白质，为人类认识生命、揭开生命奥秘迈出了可喜的一大步。这项成果获1982年中国自然科学一等奖。
1953年，英国人F. SangerSanger由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。
1、 配制JC-1染色工作液：
取适量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1，剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。
2、 设置阳性对照：
推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
3、对于悬浮细胞：
a. 取1～6×105细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后， 4℃ 600g离心3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4、对于贴壁细胞：
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
a.吸除6孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
b. 加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
d. 37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。
e. 加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5、对于纯化的线粒体：
a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。
b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。
c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。
6、荧光观测和结果分析：
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
注意事项：
1、 JC-1 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用，但应避免反复冻融。必须先把JC-1 Stain(200×)用ddH2O充分溶解混匀后，才可加入JC-1 Buffer(1×)。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否则导致JC-1很难充分溶解，严重影响后续的检测。
2、 对于6孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品；对于12孔中的样品，本试剂盒共可以检测200个样品。
3、 装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时，尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。
4、 勿把JC-1 Buffer(5×)全部配制成1×，因为操作过程中需直接使用JC-1 Buffer(5×)。
5、 如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。
6、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有一定毒性，请注意小心防护。
前一段时间，客户让我推荐大鼠的褪黑素检测试剂盒，我对这个指标也是很慎重，因为这个指标不一般。我也查了一些文献，从检测方法上，首选高效液相色谱法，但问题是检测系统最好是电化学检测，这个检测系统，我问了广州好多实验室，都没有配备；另外就是查到了Raybiotech公司的放免试剂盒，价格也不贵，3200多，但是厂家需要现订做这个试剂盒，生产周期是6个月左右，很少有客户能接受这个到货周期；第三，我查到了Millipore公司的Luminex检测系统，有这个DIY套装，突然眼睛一亮，毕竟是millipore是大品牌，而且液相芯片技术也越来越普及，权衡所有利弊，我给客户推荐了millipore的这个试剂盒。虽然客户后面因为价格问题，没有通过我采购，但是我还是感到很欣慰，因为自己的推荐还是扎根于客户的心里了。
接下来就是客户通过其他的供货商采购到了Millipore的大鼠褪黑素检测试剂盒，采用的方法是液相芯片法。然后就是在技术员的指导下进行实验，后来结果让我分析了一下，标准曲线是invalid，我发现了标准曲线中一个点偏差太大，建议客户删掉这个点，一切就OK了，试剂盒自带的control，通过计算也落在了厂家说明书的范围内。从标准曲线和control看，整个盒子没有一点问题。但是真正的问题来了，样本所计算出来的浓度大部分在20000pg/ml，这个和客户及我手头查到的文献，差别不是一个数量级了，可以认定为差了3个数量级了。Millipore的国外技术很快有了回复，经过他们的检测正常大鼠血清标本褪黑素的范围的确落在了他们试剂盒的标准曲线范围内，16000-400000pg/ml的范围，但是对于客户的疑问，他们会采用其他的方法去验证，2周后会给客户一个答复。
现在时间没有到2周，我也不知道最终的答复是什么。从这件事情上，我想了很多，很多客户做的很多指标的检测都是希望定性加定量，但是在定量的过程中，出现了各个厂家有各自的标准，整个行业没有统一的标准了，这就决定在整个试剂盒研发的过程中，任重而道远。大家过多的去相信权威，而不知道权威下面是不是掩饰了什么。
目前，我们去评价国产的ELISA试剂盒，不管你认定它是假货也好，是真实的质量有保障的也好。你去评价这些的标准是什么，认定的理由是什么，是靠经验，靠周围同学、试剂商的推荐，还是靠这些厂家的权威？目前没有统一的质控标准品或者血清样品，这些评价都是非常苍白无力的。目前为什么假的ELISA试剂盒这么猖狂，质量差的试剂盒也可以占据市场，就是因为所有盒子的标准品都是自己提供的，标准都是自己定的，自己的标准就是自己卖出试剂盒的权威认证。
版主鱼小留言:
很不错的商家感想。赞一个。
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