• Made of polypropylene• PCR® side of the tube rack holds 8 or 12 x 0.2 mL tube strips or individual tubes• Reverse side holds 0.5 mL tubes• Both sides of the tube rack have 12 wells for 1.5 mL tubes• Tubes: 0.2 mLWells: 168• Well Dia: 5.5 mm• Tubes: 0.5 mLWells: 40• Well Dia: 7.6 mm• Tubes: 1.5/2.0 mL• Wells: 12• Well Dia: 11.4 mm• Autoclavable
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科研人员所使用的“基因编辑技术”,顾名思义,能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来,就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势,技术不断改进后,更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术
这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前,有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称,曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。
那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术,为何能够获得如此这般青睐,又何以在短短两三年时间内,发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一,并有近700篇相关论文发表?它将来又会如何影响到我们的生活?
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比,其成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速风靡于世界各地的实验室,成为科研、医疗等领域的有效工具。
目前,来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA(single guide RNA)。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下:
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有(汉恒生物提供cas9质粒试剂盒):
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果,但是质粒转染具有效率低,作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题,常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒,慢病毒常用质粒见addgene(lentiCRISPR v2,lentiGuide-Puro,lentiCas9-Blast),慢病毒可以整合入宿主基因组中,长期稳定的表达(汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装),但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大(大于4kb),且长期插入可能导致乱切,脱靶等,同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因,腺病毒更有优势,腺病毒克隆能力强,获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说,作用是时间也比较长,可以达到更理想的敲除效果。
技术
近日,中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9,对抑制狗骨骼肌生长的基因(MSTN)进行了敲除,培育出两只肌肉发达的“大力神”狗,成功构建了世界首个基因敲除狗模型。
科研人员所使用的“基因编辑技术”,顾名思义,能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来,就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势,技术不断改进后,更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术
这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前,有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗?杜德娜和艾曼纽?夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称,曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。
那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术,为何能够获得如此这般青睐,又何以在短短两三年时间内,发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一,并有近700篇相关论文发表?它将来又会如何影响到我们的生活?
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比,其成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速风靡于世界各地的实验室,成为科研、医疗等领域的有效工具。
二、CRISPR/Cas系统的灵感来源
CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似,细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵,而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。
在细菌的基因组上,存在着串联间隔排列的“重复序列”,这些重复序列相对保守,我们称之为CRISPR序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列)。
1、“记录”入侵者档案
其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA,是细菌对这些外来入侵者的“记录”。(如图A所示)。
图1 CRISPR序列示意图
其中,菱形框表示高度可变的间隔序列,正方形表示相对保守的重复序列
病毒或外源质粒上,存在“原间隔序列”,“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的,这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守,我们称为PAM(Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序)。
当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时,细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别,将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”,将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。
2、打击二次入侵者
当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时,会诱导CRISPR序列的表达。同时,在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因,称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作,通过对PAM序列的识别,以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对,来找到外源DNA上的靶序列,并对其切割,降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
正是基于细菌的这种后天免疫防御机制,CRISPR/Cas9技术应运而生,从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。
三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么?
在CRISPR/Cas9技术中,我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA(guide RNA, gRNA)和Cas9蛋白。
其中,向导RNA的设计并不是随机的,待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(即三碱基序列NGG,其中N可以是任意碱基),而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例,如图3所示,在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1,向导RNA2),将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中,向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列,Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。
对于DNA双链的断裂这一生物事件,生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制,会将断裂上下游
做黄单胞,在通过Tn5构建转化子库之后,通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后,将几个可能与致病力相关的基因做了敲除,现在正在构建互补载体,已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等,不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
问下各位大神,用在线设计的软件找PAM后,还需要找functiondomains,从而排除一些PAM吗?有没有一些比较好的在线设计网站。
基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理,通过将设计好的打靶载体导入细胞后,同源臂发生同源重组,从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变,获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出:基因敲入即引入新的基因或突变;基因敲出即使某个特定的基因得到破坏,可以用于研究基因的功能。
昨日,NatureMethods上发表的一篇论文指出:CRISPR-Cas9基因编辑技术导致数百种意料之外的脱靶突变,该论文在业界引发了不小的轰动,也使该技术遭到了质疑。
众所周知,CRISPR-Cas9基因编辑技术凭借其简易、高效和多样化的特点,目前被越来越多的人认为是癌症的“控制中心”,可以用来修复导致失明的基因突变、治疗生物的遗传疾病、甚至通过编辑人类胚胎基因来找出导致不孕和流产的原因。
蛋白质数据库中编号为5AXW的金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白晶状结构
然而,昨日发表的论文联合作者、哥伦比亚大学医学中心的StephenTsang博士说,“我们一致认为,CRISPR引起的偏靶突变这一发现具有非常严重的潜在危害,其中包括单核苷酸突变和基因组非编码区域的突变。”
在这项研究中,研究人员对课题组此前获得的进行过CRISPR基因编辑的小鼠进行了全基因组测序,并进行了健康程度比对。
他们发现:CRISPR基因编辑技术确实成功修复了小鼠体内导致失明的基因,但通过全基因组测序后发现小鼠体内有超过1500个单核苷酸发生突变,并且有100个以上的位点发生发生了大片段的缺失和插入。
同时,Tsang研究团队的报告指出:上述这些突变无一通过计算机设置的算法预测到。
NatureMethod论文中的部分关键实验结果统计
StephenTsang博士进一步说道,“研究人员一般并不会使用全基因组测序手段去检测脱靶效应导致的基因突变位点,并且可能忽视了潜在的重要突变位点,因为即便是单碱基突变也有可能造成较大的影响。我们希望,这一研究结果能够鼓励其他人使用全基因组测序作为确定CRISPR技术所有脱靶效应的方法,从而达到更安全、更精准的基因编辑”。
当谈及对于CRISPR技术用于疾病治疗的前景,该研究的共同通讯作者VinitMahajan博士说:“虽然我们依然对CRISPR持乐观态度。但作为医生,我们知道,每一种新疗法都有一些潜在的副作用,我们需要知道这些副作用是什么。”
参考资料:https://www.sciencealert.com/turns-out-crispr-gene-editing-can-cause-hundreds-of-unexpected-mutations
https://eurekalert.org/pub_releases/2017-05/cumc-cge052617.php
https://phys.org/news/2017-05-crispr-gene-hundreds-unintended-mutations.html
https://phys.org/news/2017-04-accurate-dna-method.html
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