DEXPAT reagents are designed for one-step extraction of DNA from paraffin-embedded tissues fixed with 10% formalin (FFPE). The time needed for preparing PCR-ready DNA from paraffin-embedded tissue is dramatically reduced to 25 minutes from the 2–3 days required when using conventional methods.
DEXPAT reagents are designed for one-step extraction of DNA from paraffin-embedded tissues fixed with 10% formalin (FFPE). The time needed for preparing PCR-ready DNA from paraffin-embedded tissue is dramatically reduced to 25 minutes from the 2–3 days required when using conventional methods. To obtain PCR-ready DNA, simplyadd a paraffin-embedded tissue section to a tube containing DEXPAT Reagent or DEXPAT Easy, incubate it at 100°C, centrifuge at 4°C, and allow to cool on ice for 5 minutes. The refrigerated centrifugation step following heat treatment allows the formation of a gel-like layer above the absorbent resin. When collecting the DNA solution, this gel-like layer prevents contamination of the DNA by the absorbent resin.
DEXPAT Easy retains the performance of DEXPAT Reagent while offering the additional benefits of a ready-to-use reagent dispensed into individualmicrocentrifuge tubes, as well as an improved composition that facilitates separation of the aqueous DNA solution fromthe includedabsorbent resin.
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1.破碎和裂解植物细胞壁。
2.抑制rna酶
3.去除植物多糖和多酚。树脂 淀粉和纤维材料。
4.去除许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物,这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA分离。
除了干扰RNA分离之外,植物多糖和多酚及次级代谢产物还能明显抑制下游RNA反应如转录和PCR.
Trizol法和试剂盒提取组织中的RNA,哪个方法更可靠和精确呢?谢谢!
总RNA提取试剂盒(TRIzol法)
RIpure试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
无论是人、动物、植物还是细菌组织,该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIPURE试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIPURE抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用扩增级的DNase I来处理抽提的总RNA。
TRIpure试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带(mRNA和hnRNA成分),两条优势核糖体~5 kb (28S)和~2 kb(18S),低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。
准备RNA用的试剂:70%乙醇(用DEPC处理后的水稀释新开封的无水乙醇),DEPC处理后的水,新开封的三氯甲烷等,
容器:玻璃试剂瓶需要180度,8个小时以上烘烤
Eppendorf管和“枪头”:RNase-free的管子和“枪头”(可以直接买到);或者普通的ep管和“枪头”,但是需要DEPC水浸泡后,高温灭菌(121度,20-40分钟)。
如果需要使用研钵和药品匙,研钵和药品匙也是需要180度,8小时以上的烘烤。
还需要没开封的手套,提取RNA时,尽量勤换手套,少说话,尽量不要对着样品吹气。
1、RNA提取为什么用异丙醇,而且是等体积的?
2、为什么用氯仿,RNA为什么在上清中,中间和下层分别有什么?
3、RNA提取最后为什么用75%乙醇洗,而且为什么使用的是75%乙醇而不用无水乙醇来洗。还有有人建议用完75%乙醇后用无水乙醇洗,会使水分快速蒸发,可行吗?
谢谢大家啦,帮帮忙。
步骤
A. 真核细胞和组织
自己需要的材料:
β-巯基乙醇、70%乙醇(DEPC水配置)、除RNase的枪头和EP管。
材料的最佳量
想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果,选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的,根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。
细胞的步骤
1. 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞(≤1*107),使细胞团松散,轻轻弹EP管或者用枪头吹旋,再用漩涡振荡混匀。
a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
b) 如果是单层的组织培养细胞(成纤维细胞,内皮细胞等),可以直接在细胞培养器里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或250px的培养皿中,更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面,确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。
c) 如果细胞是悬液培养,收集细胞(≤1,500rpm or 400*g)*5min,弃上清,加入TRK裂解液,漩涡振荡混匀,转移到1.5ml EP管中,进行步骤2。
2. 匀浆化裂解产物
“裂解和匀浆化样品”-第四页有详细的说明,如果细胞≤1*105,漩涡振荡1min。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA的产量还容易造成柱子堵塞。
a) 用匀浆器30 s,使样品匀浆化。
b) 用钝的针头的注射器(0.9mm直径),至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除RNase。
3. 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column中,离心,≥1,4000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。转到总RNA分离中第4步。
组织的步骤:
1. 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞(≤30mg),使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
500ulTRK裂解液最大裂解能力30mg,难破碎的组织大于20mg就用700ul的TRK裂解液。当组织量超出建议的最大量时,也不要超过40mg。
组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用,除非是使用液氮,
2. 离心,≥1,5000*g, 5min, 室温。
3. 转移上清至,Homogenization Spin Column中,离心,≥1,3000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。
总RNA分离:
4. 在裂解产物中加入50%体积(250ul-350ul)的无水乙醇(96%-100%)混匀,漩涡振荡20s。
5. 样品转移到Hibind RNA Mini column上,离心管的最大容量为750ul,加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心,10,000*g,0.5-1min。弃去流出液(透过柱子流出到离心管里的液体)。
6. 将柱子放在一个新的2ml收集管中,加上300ul RNA wash buffer I。室温离心,10,000*g, 0.5-1min。同样弃掉流出液。
7. DNase I 消化(选择性)
在我的实验中没有做这一步。
8. 将柱子再放到一个新的2ml收集管中,加入400ul RNA wash buffer I, 室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。
9. 将柱子放到2ml收集管中,加入500ul RNA wash buffer II(乙醇稀释过的),室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。注意:使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释(48ml),按照标签上的说明。
10. 用500ul RNA wash buffer II洗涤一次柱子,同上一步骤一样。室温离心,10,000*g, 30s,弃流出液。然后在空收集管中,以最大转速离心柱子,≥12,000*g, 2min, 室温,使的HiBind 基质完全干燥。
11. 转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中,(试剂盒中没有提供),加入50-100ul的DEPC水洗脱柱子(试剂盒中提供)。确保水直接加到了柱子的基质上。10,000*, 1min, 室温。如果RNA的总量大于30ug,可以进行二次洗脱。
注意:可以选择性地,用大一点的体积洗脱RNA。如果进行二次洗脱,总RNA的量会增加,但是浓度会降低,因为80%以上的RNA会在第一次时被回收。在加柱子前将水加热到65℃并室温孵育柱子5min会增加产量。
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