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Trypsin Separopore® 4B

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EDTA和Tris的混合液,配方:Tris-Cl (pH7.4) 20mM,EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂,提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。⑴ 匀浆 对于组织,可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温,快速匀浆 查看更多>
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聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶,其参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式之一。PARP-1在DNA修复和细胞凋亡中发挥至关重要的作用。在凋亡过程中,PARP-1由116kDa被切割成85kDa,催化NAD-依赖的多聚(ADP-核糖)(PAR)往各自质膜以及核蛋白上的聚合。总而言之,PARP在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用。
**捷向您推荐美国Trevigen的一款通用PARP分析试剂盒检测试剂盒。该试剂盒是检测凋亡前与凋亡中细胞提取液中PARP活性的理想方案,操作简单,重复性高。其通过检测96孔板上生物素标记的多聚ADP核糖聚合到邻近组蛋白的反应,从而确定已知的或可能的PARP抑制剂。试剂盒中的依托泊苷(Etoposide)是拓扑异构酶Ⅱ抑制剂,在拓扑异构酶Ⅱ切割完DNA后能够稳定该酶。在试剂盒中,依托泊苷作为凋亡诱导的对照参与检测。
通量PARP/凋亡分析试剂盒可广泛应用于1)检测原代、肿瘤等细胞的PARP活性;2)检测凋亡前后的PARP活性;3)利用细胞裂解液筛选PARP抑制剂。
试剂盒特色比色法/化学发光法,无放射性输出。96well,高通量检测。极大地节省了分析时间,提高了使用效率。高敏感性。能够检测到500个细胞中低至0.1mU的PARP。检测范围广。0.1-10mU。样本用量少。仅仅需要10-100ng的提取物。检测时间短。仅需要3h即可完成检测。

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Trevigen是一家快速成长的美国生物技术公司,专注于细胞凋亡、DNA损伤和修复、肿瘤细胞功能与行为等方面研究的肿瘤研究产品和服务。作为Trevigen在中国区域的总代理,**捷与Trevigen一道为中国的科研工作者提供最好、最新的氧化应激、细胞损伤和肿瘤细胞行为研究等领域内的优质产品和技术服务。如果您对上述产品及方案感兴趣,请致电400-6800-868至**捷科技有限公司垂询血管生成研究的相关实验解决方案,或索取最新的产品资料。
我是提细胞总蛋白的,6cmdish,我现在是用250ul裂解液的量,可是测出来的蛋白浓度比较低(1ug/ul),提细胞前在显微镜下看了细胞长满了,是不是我的裂解液量加的太多了,应该加多少量比较适合?请教。
细胞总蛋白提取方法123
coollanlan2021-08-04
最近将长满的100毫升的细胞培养瓶的细胞进行总蛋白的提取,每次只加了100微升的三去污溶液,最后测的溶度还是比较低,5微升里最多只有十几微克的总蛋白。不知道大家的经验是什么?如何提高细胞总蛋白的浓度?
蛋白在细胞内,需要把细胞裂解才能提出
DNA提取加细胞裂解液的量是固定的吗?有的书上说加50μl,有的加500μl,不知为什么,请指教!谢谢!
从细胞中提取RNA的方法123
陌语哲俀2021-07-22
操作步骤:
样品处理:
a. 植物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混匀。
b. 动物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液,用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
c. 贴壁细胞:直接在培养板中加入裂解液裂解细胞,每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。
d. 细胞悬液:离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。
e. 血液处理:取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟,10000rpm离心1分钟。弃上清,若沉淀含有红细胞,可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。
将处理后的样品在室温放置5分钟,使得核酸蛋白复合物完全分离。
向匀浆样品中加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置3-5分钟。
2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中,把水相转移到新管中,不要吸到沉淀。
吸附柱前处理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液,室温放置2分钟,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀,加入吸附柱静置2分钟,2-8℃ 12000rpm离心2min,弃废液。7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。9. 12000rpm离心2min,弃掉收集管,将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。10. 将吸附柱放入新管中,向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O,室温放置5min,12000rpm室温离心2min即得到RNA。

注意事项:
所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品,操作过程要小心,带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯,需电泳检测。
各位大侠:俺在提取细胞总蛋白时,蛋白质提取出像果冻一样的东西,俺的步骤如下:
1细胞用冷PBS洗两遍,离心,去除上清;
2加50~100ul三去污细胞裂解液;
3加PMSF,AP各1ul;
4用100ulTIp头吹打数次;
5置冰上15分钟
612000rpm,15min,4度
7取上清。这时,上清呈黏液状,用枪头吸时会将细胞碎片一起吸出。拉丝度很长,测蛋白浓度显示有,各位,这是怎么回事?做WB会影响结果吗?这种蛋白质在保存过程中会容易降解吗?
有的资料上显示第四步,不是用Tip头吹打,而是将EP管在桌上猛敲击几下,这个方法我也试过,但是结果蛋白浓度很低,没有出现上述现象,这是怎么回事呀?
裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解.化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂.这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法.机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性.机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂.
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),.原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂).7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.
我想问一下我提出大鼠脑线粒体后提线粒体蛋白的方法:用常规细胞裂解液【7mmol/L尿素(urea)、2mmol/L硫脲(thiourea)、4%CHAPS、10mmol/L硫苏糖醇(DTT)、pharmalyte(载体两性电介质就是IPG的buffer)pH3-10(1:50稀释)】60-100ul,吹打并振荡使蛋白尽量溶解。12000g离心10min。收集上清即为蛋白质提取物。

这样可不可以?

另还有几个问题:1、这样的裂解液裂解线粒体提蛋白可不可以
2、裂解液加多少剂量
3、12000g离心10min和30分钟有没有区别
如果要培养,用淋巴细胞分离液。如果只是用于检测,用红细胞裂解液
可以用温和的红细胞裂解液,和外周血一样,裂解液不会对单个核细胞有影响,HY StemCell是一家为干细胞研究服务的知名公司,有各种生化试剂供客户选择,可以查询各大品牌红细胞裂解液,供参考
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