Isotype controls are most commonly used in flow cytometry and immunohistochemistry experiments as negative controls that measure the level of non-specific background signal caused by primary antibodies. Background signal is due to Igs binding to non-specifcally to Fc receptors present on a cell surface (ex. mice antibodies binding to human leukocytes non-specifically in which investigators would want to use a mouse isotype control when working with human cells or tissues).
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英 ['aɪsətaɪp]美 ['aɪsəˌtaɪp]
n. 同型动物(或植物),图形文字,象征性图像;同位型;同模;同号模式
同型对照(阴性对照)管:A同型+B同型+C同型
单阳性对照
A检测管:A+B同型+C同型
B检测管:B+A同型+C同型
C检测管:C+A同型+B同型
不存在荧光重叠的两个抗体不需要调节补偿。
样本为PBMC,想用三色标记Treg细胞,分别为CD4-PECY,CD25-Fitc,Foxp3-PE,想知道如何设置荧光补偿,用的是BD的流式仪,1、是设置阴性管一个,单阳性管每种一个,样品管一个么?
荧光素强度依次为PE, PECY5 APC FITC, PE最强,FITC最弱。 所以,建议抗体组合为:
Foxp3-PE,CD4-FITC,CD25-PECy5.5或者CD25-APC。
同时购买三个相应的同型对照抗体。
样品管设置如下:
1. cell + FITC-isotype + Pecy5.5( or APC)-isotype + PE-isotype
2. Cell + FITC-isotype + CD25-mAb + PE-isotype
3. Cell + PE-mAb + FITC-isotype + Pecy5.5( or APC)-isotype
4. Cell + CD4-FITC + Foxp3-PE + CD25 -PECy5.5( or APC)。 [这一管的数据可以拿来分析用]。
在充分了解调整电压和补偿原理的基础上,也可以做一些简化。如果不太懂,就按照这个来。其中Foxp3的抗体和同型对照抗体都是在固定破膜以后再加,不是与CD4或者CD25同时加。
比如你用anti-MHC-II,mouse IgG1-FITC,那同型就用非特异性的mouse IgG1-FITC,同样浓度
手头上,有eBioscience家的同型抗体,为PE标记(mouseIgG1,k),说明书写使用为2.5ug/test。
按照说明书的浓度加入后结果发现,同型对照抗体组比实验组和阴性对照组(不表达CD80)荧光强度要高,很明确我的同型对照加入的剂量多了,但正确的加法是多少?按照质量算吗?请高手指教,非常感谢!!
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