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鉴定分析植物蛋白复合物的蓝绿非变性凝胶电泳实验 ...

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试剂、试剂盒	十二烷基β-D-麦芽糖苷增溶液TritonX-100增溶液洋地黄阜苷增溶液考马斯亮蓝染色液丙烯酰胺溶液BN凝胶缓冲液
实验步骤	3.1BN-PAGE样品的制备所有样品制备步骤必须在4°C下操作，在开始制备样品前（见26.3.1节1和26.3.1节2)，要制备好BN凝胶（见26.3.2)。 1.膜组分 (1)按照标准的方法步骤制备要研究的膜组分，如细胞质膜、类囊体膜或线粒体膜。或者使用完整细胞器，如质体、线粒体或过氧化物酶体，作为BN-PAGE的初始实验材料。 (2)确定蛋白质浓度，如用Lowry方法等。 (3)将蛋白质浓度调为10μg/μl。 (4)15000g离心100μl样品10min，沉淀膜或细胞器组分。 (5)用十二烷基β-D-麦芽糖苷，TritonX-100或洋地黄皂苷增溶液悬浮沉淀物（见注释1)。 (6)将悬浮液置于冰上15min。 (7)20000g离心20min，去除不容物。 (8)加入5μL考马斯亮蓝染色液。 (9)直接加样50~100μl的上清液（相当于0.5~1.0mg蛋白质）到BN胶上（蛋白质的定量为可被考马斯亮蓝染色，如用银染，蛋白质量可减少到1/10)。 2.水溶解组分 (1)按照标准方法制备要研究的水溶性蛋白质，所用的缓冲液不能含高盐浓度或者离子去垢剂。蛋白质浓度要调节到10μg/μl。 (2)在100μl样品中加入2μl考马斯亮蓝染色液。 (3)20000g离心20min，去除不溶物。 (4)直接加样50~100μl的上清液（相当于0.5~1.0mg蛋白质）到BN胶上（如用银染，减少蛋白样品的加样量，见26.3.1节1中第（a)步骤）。 3.2BN-PAGE 如果电泳分离距离大于12cm，BN凝胶就可以获得最好的分辨能力。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪（Bio-Rad，Richmond，CA；凝胶尺寸：0.15cmX16cmX20cm)上做的实验，其他公司生产的电泳仪，如HoeferSE-400或SE-600电泳仪（GE Healthcare, Munich, Germany)，也同样适用于 BN-PAGE电泳。由于蛋白复合物的分子质量可从50kDa到几千kDa，所以有时要用到梯度凝胶来分离(见注释2)。 (1)将1.8ml丙烯酰胺溶液，3.3mlBN凝胶缓冲液，14.9ml双蒸水混合在一起，配制成4.5%分离胶溶液。 (2)将6.7ml丙烯酰胺溶液，3.3mlBN凝胶缓冲液，6.0ml双蒸水，4ml甘油混合在一起，配制成16%分离胶溶液。 (3)将这两种溶液分别灌入梯度生成器中，在这个梯度生成器上连接软管和针头，并与做胶的两块玻璃板之间的空间连接，这样就可以从顶部灌胶（16%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间），或从底部灌胶（4.5%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间）。 (4)在这两种凝胶溶液中加入TEMED和APS (90μl10%APS/9μlTEMED加入到4.5%分离胶溶液中；65μlAPS/6.5μlTEMED到16%分离胶溶液中）。 (5)灌梯度胶，在顶部为浓缩胶留一定的空间，用双蒸水封胶液，凝胶将在60min内聚合。 (6)倒掉双蒸水。 (7)将1.2ml丙烯酰胺溶液，2.5mlBN凝胶缓冲液，11.3ml双蒸水混合在一起，配制成浓缩胶溶液。 (8)在浓缩胶溶液中加入65μlAPS和6.5μlTEMED，将其倒入插梳周围的空间，浓缩胶将在30min内聚合。 (9)稀释相应的电泳缓冲液的浓缩储液，分别制备成1X的阳极和阴极电泳缓冲液。 (10)当浓缩胶聚合后，小心移走插梳。 (11)将阳极和阴极电泳缓冲液分别加到电泳仪的上、下槽内，冷却电泳仪到4°C。 (12)将经考马斯亮蓝预处理的蛋白样品加样到凝胶凹槽里。 (13)将电泳仪与稳压电源连接，一开始时，100V恒定电压电泳45min，接着以15A恒定电流电泳8h。要在4°C电泳，电泳过程中可看到BN胶上的条带。 3.3第二相的SDS-PAGE 1DBN-PAGE分离的蛋白复合物可用考马斯亮蓝染色或银染，用胶内酶学检测了解其活性，或转移到印迹膜进行进一步的分析（见注释3和注释4)。用第二相有SDS存在的凝胶电泳能分离出蛋白复合物的亚基组分，所有已发表的SDS-PAGE实验方法都可与BN-PAGE结合，如Laemmli发表的电泳系统[24]。但是一般来说，Schagger和vonJagow[25]开发的Tricine-SDS-PAGE系统的分辨率最高。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪（Bio-Rad，Richmond，CA；凝胶尺寸：0.15cmX16cmX20cm)上做的实验，其他公司生产的电泳仪也同样适用。 (1)剪下一条BN胶，室温下将其浸泡在变性处理溶液中30min。 (2)用双蒸水冲洗胶条30~60s(这一步骤很重要，因为β-巯基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。 (3)将胶条放在电泳仪的玻璃板上的正常胶梳的梳齿位置上。 (4)再用1mm橡皮密封条、第二块玻璃板和夹子等，组装凝胶电泳仪。将所有需要的东西倒入灌胶器中（与第一向的胶条厚度（1.5mm)相比，减少第二向凝胶的厚度到1.0mm，以避免第二向胶条沿着垂直方向滑落下去）。 (5)将10ml的丙烯酰胺溶液、10ml的SDS凝胶缓冲液、10ml双蒸水、100μl的APS和10μl的TEMED混合在一起，配制成16%分离胶溶液，将其倒入电泳仪两块玻璃板之间的BN胶条以下的空间，为嵌入BN胶条的样品胶溶液留下空间。用封胶溶液封胶面，大约60min内凝胶聚合。 (6)将4.1ml的丙烯酰胺溶液、6.7ml的BN凝胶缓冲液、2ml甘油、200μl的SDS溶液、6.8ml双蒸水、160μl的APS和16μl的TEMED混合在一起，配制成10%样品胶溶液。 (7)倒掉封胶溶液，倒入样品胶将BN胶条嵌入，倾斜凝胶架子，使BN胶条下面的空气释放出来。 (8)分别在电泳仪的上、下槽加入SDS阳极和阴极电泳缓冲液。 (9)将电泳仪接上稳压电源，30mA电流下，电泳过夜。作为一个替代系统，第二向电泳可在天然条件下进行（见注释7)。 3.4染色用所有的标准蛋白质染色方法可以显色2DBN凝胶上分离的蛋白质，如考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等。如果接着用质谱仪鉴定蛋白质，建议使用考马斯亮蓝染色，下面介绍由Nenhoff等开发的基于胶态考马斯亮蓝染色的实验指导。 (1)将凝胶在固定液中固定处理1h。 (2)混合80ml新鲜配制的染色液和20ml乙醇溶液。 (3)将凝胶浸泡在上述溶液中过夜。 (4)用双蒸水冲洗凝胶，脱色，要中途换水直至背景清晰（如果背景颜色无法用水脱除，可使用20%的乙醇溶液脱色）。

实验步骤

3.1BN-PAGE样品的制备

所有样品制备步骤必须在4°C下操作，在开始制备样品前（见26.3.1节1和26.3.1节2)，要制备好BN凝胶（见26.3.2)。

1.膜组分

(1)按照标准的方法步骤制备要研究的膜组分，如细胞质膜、类囊体膜或线粒体膜。或者使用完整细胞器，如质体、线粒体或过氧化物酶体，作为BN-PAGE的初始实验材料。

(2)确定蛋白质浓度，如用Lowry方法等。

(3)将蛋白质浓度调为10μg/μl。

(4)15000g离心100μl样品10min，沉淀膜或细胞器组分。

(5)用十二烷基β-D-麦芽糖苷，TritonX-100或洋地黄皂苷增溶液悬浮沉淀物（见注释1)。

(6)将悬浮液置于冰上15min。

(7)20000g离心20min，去除不容物。

(8)加入5μL考马斯亮蓝染色液。

(9)直接加样50~100μl的上清液（相当于0.5~1.0mg蛋白质）到BN胶上（蛋白质的定量为可被考马斯亮蓝染色，如用银染，蛋白质量可减少到1/10)。

2.水溶解组分

(1)按照标准方法制备要研究的水溶性蛋白质，所用的缓冲液不能含高盐浓度或者离子去垢剂。蛋白质浓度要调节到10μg/μl。

(2)在100μl样品中加入2μl考马斯亮蓝染色液。

(3)20000g离心20min，去除不溶物。

(4)直接加样50~100μl的上清液（相当于0.5~1.0mg蛋白质）到BN胶上（如用银染，减少蛋白样品的加样量，见26.3.1节1中第（a)步骤）。

3.2BN-PAGE

如果电泳分离距离大于12cm，BN凝胶就可以获得最好的分辨能力。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪（Bio-Rad，Richmond，CA；凝胶尺寸：0.15cmX16cmX20cm)上做的实验，其他公司生产的电泳仪，如HoeferSE-400或SE-600电泳仪（GE Healthcare, Munich, Germany)，也同样适用于 BN-PAGE电泳。由于蛋白复合物的分子质量可从50kDa到几千kDa，所以有时要用到梯度凝胶来分离(见注释2)。

(1)将1.8ml丙烯酰胺溶液，3.3mlBN凝胶缓冲液，14.9ml双蒸水混合在一起，配制成4.5%分离胶溶液。

(2)将6.7ml丙烯酰胺溶液，3.3mlBN凝胶缓冲液，6.0ml双蒸水，4ml甘油混合在一起，配制成16%分离胶溶液。

(3)将这两种溶液分别灌入梯度生成器中，在这个梯度生成器上连接软管和针头，并与做胶的两块玻璃板之间的空间连接，这样就可以从顶部灌胶（16%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间），或从底部灌胶（4.5%分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间）。

(4)在这两种凝胶溶液中加入TEMED和APS (90μl10%APS/9μlTEMED加入到4.5%分离胶溶液中；65μlAPS/6.5μlTEMED到16%分离胶溶液中）。

(5)灌梯度胶，在顶部为浓缩胶留一定的空间，用双蒸水封胶液，凝胶将在60min内聚合。

(6)倒掉双蒸水。

(7)将1.2ml丙烯酰胺溶液，2.5mlBN凝胶缓冲液，11.3ml双蒸水混合在一起，配制成浓缩胶溶液。

(8)在浓缩胶溶液中加入65μlAPS和6.5μlTEMED，将其倒入插梳周围的空间，浓缩胶将在30min内聚合。

(9)稀释相应的电泳缓冲液的浓缩储液，分别制备成1X的阳极和阴极电泳缓冲液。

(10)当浓缩胶聚合后，小心移走插梳。

(11)将阳极和阴极电泳缓冲液分别加到电泳仪的上、下槽内，冷却电泳仪到4°C。

(12)将经考马斯亮蓝预处理的蛋白样品加样到凝胶凹槽里。

(13)将电泳仪与稳压电源连接，一开始时，100V恒定电压电泳45min，接着以15A恒定电流电泳8h。要在4°C电泳，电泳过程中可看到BN胶上的条带。

3.3第二相的SDS-PAGE

1DBN-PAGE分离的蛋白复合物可用考马斯亮蓝染色或银染，用胶内酶学检测了解其活性，或转移到印迹膜进行进一步的分析（见注释3和注释4)。用第二相有SDS存在的凝胶电泳能分离出蛋白复合物的亚基组分，所有已发表的SDS-PAGE实验方法都可与BN-PAGE结合，如Laemmli发表的电泳系统[24]。但是一般来说，Schagger和vonJagow[25]开发的Tricine-SDS-PAGE系统的分辨率最高。下面所介绍的方法是在Bio-Rad公司的ProteinII电泳仪（Bio-Rad，Richmond，CA；凝胶尺寸：0.15cmX16cmX20cm)上做的实验，其他公司生产的电泳仪也同样适用。

(1)剪下一条BN胶，室温下将其浸泡在变性处理溶液中30min。

(2)用双蒸水冲洗胶条30~60s(这一步骤很重要，因为β-巯基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。

(3)将胶条放在电泳仪的玻璃板上的正常胶梳的梳齿位置上。

(4)再用1mm橡皮密封条、第二块玻璃板和夹子等，组装凝胶电泳仪。将所有需要的东西倒入灌胶器中（与第一向的胶条厚度（1.5mm)相比，减少第二向凝胶的厚度到1.0mm，以避免第二向胶条沿着垂直方向滑落下去）。

(5)将10ml的丙烯酰胺溶液、10ml的SDS凝胶缓冲液、10ml双蒸水、100μl的APS和10μl的TEMED混合在一起，配制成16%分离胶溶液，将其倒入电泳仪两块玻璃板之间的BN胶条以下的空间，为嵌入BN胶条的样品胶溶液留下空间。用封胶溶液封胶面，大约60min内凝胶聚合。

(6)将4.1ml的丙烯酰胺溶液、6.7ml的BN凝胶缓冲液、2ml甘油、200μl的SDS溶液、6.8ml双蒸水、160μl的APS和16μl的TEMED混合在一起，配制成10%样品胶溶液。

(7)倒掉封胶溶液，倒入样品胶将BN胶条嵌入，倾斜凝胶架子，使BN胶条下面的空气释放出来。

(8)分别在电泳仪的上、下槽加入SDS阳极和阴极电泳缓冲液。

(9)将电泳仪接上稳压电源，30mA电流下，电泳过夜。

作为一个替代系统，第二向电泳可在天然条件下进行（见注释7)。

3.4染色

用所有的标准蛋白质染色方法可以显色2DBN凝胶上分离的蛋白质，如考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等。如果接着用质谱仪鉴定蛋白质，建议使用考马斯亮蓝染色，下面介绍由Nenhoff等开发的基于胶态考马斯亮蓝染色的实验指导。

(1)将凝胶在固定液中固定处理1h。

(2)混合80ml新鲜配制的染色液和20ml乙醇溶液。

(3)将凝胶浸泡在上述溶液中过夜。

(4)用双蒸水冲洗凝胶，脱色，要中途换水直至背景清晰（如果背景颜色无法用水脱除，可使用20%的乙醇溶液脱色）。

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发布于： 2018-08-06 阅读（250）

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