5.2.1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳_实验⽅法_
| 试剂、试剂盒 | 10XMOPS电泳缓冲液甲醛甲酰胺10X加样缓冲液溴化乙锭琼脂糖DEPC处理的水 仪器、耗材 | 水平电泳装置水浴 实验步骤 | (一）材料与设备 1)水平电泳装置 2)水浴 3)10XMOPS电泳缓冲液：0.2mol/LMOPS(PH7.0)，20mmol/L乙酸钠，10mmol/LEDTA(pH8.0) 4)甲醛;37%溶液（13.3mol/L) 5)甲酰胺（去离子）：将10ml甲酰胺和lg离子交换树脂混合，搅拌lh后用Whatman滤纸过滤，等分成1ml于一70°C储存。 6）10X加样缓冲液：10mmol/LEDTA(pH8.0)，0,25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油 7)溴化乙锭 8）琼脂糖 9)DEPC处理的水 (二）操作方法 1)凝胶制备：制100ml.含冇2.2mol/L甲醛和1I.5%琼脂糖凝胶。将1.5g琼脂糖溶解在72ml.水屮，微波炉加热溶解后冷却到55X：,加入10ml10XMOPS电泳缓冲液和18mL,去离子甲醛，然后灌胶。 2)样品制备；分光光度下测以确定的浓度。如果RNA浓度太低(<lmg/ml)，可用乙醇或异丙醇沉淀浓缩。 3)电泳：在l.5mL的离心管中加入下列组分进行变性反应， RNA〔最多20ug） 2ul 10XMOPS 2ul 甲醛 4ul 甲酰胺 10ul 溴化乙锭（200ug/ml) 1ul 混匀后，于55℃保温60min使RNA变性，冰中冷却110min,离心，加2ul10X加样缓冲液混匀，置于冰上，上样电泳，用1XMOPS作电泳缓冲液，直到溴酚蓝到达凝胶的底部。在紫外灯下观蔡结果。 4)RNA的分子质量标记。①使用商品化RNA分子的大小标准.②利用细胞中两个主要核糖体RNA:18S(约2.lkb)和28S(约4.5kb)作分子质量参照。 注意事项 | 1)为了获得高分辨率.可以在凝胶中加入更多的甲酵.以较低的电流如20mA电泳过夜。在冷室中跑胶或用循环泵防止过热，但不必一定如此。 2)对样品的染色也可在电泳后进行，将凝胶置于溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)中染色10min„如果背景过高可在水屮脱色30min。 3)含甲醛的琼脂糖凝胶较普通胶脆，应小心操作。 4)在含甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA比等长的DNA迁移速度快，一般不用DNA标准分子质量参照物测量未知分子大小。 5)用于RNA电泳的电泳槽要用去污剂溶液洗净，再用水冲洗，用乙醇干燥后再灌满3%的过氧化氢，于室温放置10min后，再用DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。 |
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发布于 ： 2021-09-20
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