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求Illumina二代测序过程使用的酶，包括测序前样品准备过程和上机过程，越详细越好，最好是有相关的技术文档。

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.
第一部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min.
7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）
7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.
9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度,过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；
3）42度, 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；
7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.
3：取白斑,划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度,孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
一、准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 。
12. 模板抑制试剂(TSR) 。
13. 10×电泳缓冲液 。
14. 全自动DNA测序仪。
15. PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待测的质粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl
待测DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
灭菌去离子水 2 μl 2 μl
总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。
3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
五、上机操作 　　1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。　　2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。　　3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。　　4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。　　5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
六、序列分析 　　仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
七、仪器清洗 　　测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
八、计算
1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。
2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03～2pmol模板DNA，随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
一、试剂准备
1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
3. 10%过硫酸铵，0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，定容至5 ml，应新配新用。
4. 10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
5. TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
8. 染色溶液：硝酸银2 g，甲醛3 ml，溶于2升超纯水中备用。
9. 显影溶液：60 g碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、测序反应
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（约20 μl）矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA ：2.1 pmol
5×测序缓冲液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
无菌ddH2O 至终体积16 ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf（+）对照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×测序缓冲液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以【注意】中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
【注意】
（1）测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200 bp（PCR产物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋质粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
（2）计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数
计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n为模板碱基对数
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n为模板碱基数
（3）为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟，然后： 95℃ 30秒（变性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分钟（延伸）。
模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟，然后：95℃ 30秒（变性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
三、测序凝胶板的制备
1. 玻璃板的处理
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高（棕色）。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鲜的粘合溶液。
② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板，整个板面都必须擦拭。
③ 4～5分钟后，用95%乙醇单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程，每次均须换用干净的纸，除去多余的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷，使凝胶不能很好地粘附。
② 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的，否则将导致凝胶撕裂。
（2）长玻璃板的处理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
② 5～10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。
2. 凝胶的制备
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%～8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2 ml，并用0.45 mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4～6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
（3）胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
四、电泳
1. 预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30 V/cm的电压预电泳20～30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
【注意】
① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2. 样品的制备
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1～3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3. 上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40～60 V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55 cm长，0.2 mm厚的凝胶板，在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
【注意】
① 上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
② 一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
五、测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10～20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影
（1）在显影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸钠溶液（400 μl）以完成显影液的配制。
（2）从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5～10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。
（3）立刻将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2～3分钟或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
【注意】
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响
① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。
② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可获得较好的结果。
③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4～6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
⑤ 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10～12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
六、EDF胶片显影
使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶（胶面向上）置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20～40秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程：
（1） 在Kodak GBX显影液中显影1～5分钟；
（2） 水洗1分钟；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分钟；
（4）水洗1分钟。
【注意】
① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。
② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。 “鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。
二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
五、对阳性克隆（含1kbp～2kbpInsert）进行DNA测序。
六、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。向左转|向右转

利用DHPLC基因扫描技术进行深入彻底的突变与SNP筛查
StanLLilleberg
变性高效液相色谱（DHPLC）是一种新型遗传变异筛查技术，可用于单碱
基替换（或单核苷酸多态性），小片段缺失或插入等多种基因突变的检测。
DHPLC基因扫描技术可在生殖细胞系和体细胞系中筛查遗传变异。而像特定位
点DNA甲基化状态的改变等遗传现象也可用在DHPLC基础上建立的方法来检
测。遗传变异的生物学效应是由突变基因的位置和特点决定的，而功能相关基
因突变的发现对相关药物的研发有很大的促进作用。本文将对DHPLC技术在
突变检测领域的应用实例进行介绍和讨论；介绍的重点分别是致病基因突变位
点的确认，以及药物代谢和耐药性相关基因突变的检测。
关键词：候选基因，变性高效液相色谱，DNA甲基化，药物代谢，抗药性，
遗传变异，基因突变，遗传药理学，SNP筛查，SNP确认，体细胞变异。
缩略词
5-FU---5-氟尿嘧啶，AD---阿尔茨海默病，早老性痴呆，APP---淀粉样前体蛋白
AS---安格尔曼综合征，快乐木偶综合征，BWS---贝-威综合征，CF---囊性纤维
化，CHF---充血性心衰，CMT---沙-马-图病，进行性神经性（腓骨）肌萎缩，
COX-2---环氧合酶-2，CP---慢性胰腺炎，DHPLC---变性高效液相色谱，DPD---
二氢嘧啶脱氢酶，EOAD---早发性阿尔茨海默病，GIST---胃肠道基质瘤，
LOAD---迟发性阿尔茨海默病，HCM---肥大性心肌病，MLST---多位点序列分
型，PCR---聚合酶链氏反应，PWS---普-威综合征，SNP---单核苷酸多态性，
TPMT---硫代嘌呤-S-甲基转移酶，VEGF---血管内皮生长因子
介绍
当今的基因技术**已为医学和制药工业的发展开辟了新的途径。基因突
变和单核苷酸多态性（SNP）等DNA序列变异的确定正在成为新药研发的重要
组成部分[1]。而许多功能基因组，临床诊断和遗传药理学研究中的重大发现也
是通过检测基因突变和SNP实现的。分子遗传学的研究将对普通临床病症的分
子水平缺陷给予更好的解释，并最终促进针对这些缺陷的新疗法的产生。而遗
传变异研究在新药开发中最有意义的作用就是为药物治疗靶点的识别，描述和
确认提供信息支持[2]。
对一种可能的药物靶点进行遗传学分析可了解目的基因发生突变的程度。
对靶序列突变的分析描述是药物开发早期工作中的关键环节，它可为药物设计
提供最合适的突变靶点。而在药物靶点的确定过程中，遗传变异也可被用来证
明特定靶点与疾病表现型之间的关联。而特定靶基因突变与临床指征或标志之
间的正性关联将会对评估该药物靶点的临床相关性以及治疗价值提供强有力的
支持。这种遗传学分析通常在靶点确定过程的早期完成，为特定药物靶点的选
择提供证据支持。
遗传变异的分析在药物研发的后续过程中也有作用。例如在遗传药理学方
面，编码药物代谢酶类的基因发生突变等遗传因素可能影响受药个体对特定药
物的反应，进而影响该个体使用该药物的有效性和安全性[3]。遗传药理学的实
验数据可在药物研发和临床用药过程中起到辅助作用。此外，药物靶点本身以
及疾病相关基因的遗传变异也可对药物的治疗结果产生影响。这些遗传变异可
以成为有力的药效指标，也可以成为临床诊断和预后的标志物[4，5]。当深入
了解了各种疾病的遗传变异机理后，人们就可制定相应的治疗策略对这些疾病
进行正确的诊断和治疗了。
由上可知，遗传变异检测的作用不仅存在于药物靶点的识别和确定阶段，
而且贯穿于整个药物的研发过程中。因此，对编码特定药物靶点，疾病通道蛋
白，药物代谢酶类和耐药性相关蛋白的基因进行扫描，以便检测对药物疗效和
毒性有影响的SNP和基因突变是很有必要的。这些基因序列的改变有可能对其
表达的蛋白质的结构和（或）功能以及表达水平具有深远的影响。
理想的突变和SNP检测技术应当具有准确性和敏感性高，完全自动化，检
测成本低等特点。此外理想的检测技术在PCR反应引物的修饰，反应试剂的搭
配，检测标记以及PCR反应后处理等方面也应没有特殊的要求。变性高效液相
色谱（DHPLC），一种能够满足上述所有要求的新兴技术，已经逐渐发展成突
变检测的首选技术。DHPLC这种准确高效的基因筛查技术的发展，极大地促进
了新的突变位点的发现，并对了解疾病发生发展机制，确定药物研发方向做出
了重要贡献。本文将对近年来利用DHPLC技术确定基因序列突变的相关报道
进行介绍，并深入探讨这些发现的生物学意义。
利用DHPLC技术检测遗传变异
DHPLC技术可以通过温度调节的异源双链分析，自动检测单碱基替换，小
片段插入和缺失等基因序列的改变。关于DHPLC技术的工作原理和应用范围，
在Xiao和Oefner的综述[6]中有详尽的介绍。DHPLC基因突变筛查，就是利用
离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR反应产物
进行分离（图1）。在待测样品部分变性和乙晴冲洗梯度呈线性增加的情况下，
带有突变序列的异源双链，与同源双链(野生型或阴性对照)相比，它们的柱保
留时间相对较短。因此，带有突变序列的样品呈现出异源和同源双链混合物的
峰型特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰型。出现与野生型或阴
性对照不同的DHPLC冲洗结果，说明检测样品含有突变序列。DHPLC技术为
确定带有突变序列的样品提供了一种简便而直观的途径，该种方法对生殖细胞
系和体细胞系的基因突变检测同样适用。
图一
图2展示了利用DHPLC技术检测DNA序列变异，以及通过测序技术确定
特定的碱基改变的过程。整个实验流程非常简便。首先从合适的来源分离DNA
和RNA，然后通过PCR或RT-PCR（模板为RNA）反应，扩增目的基因的特
定区域（即扩增子），扩增子一般包括一个外显子以及相应的外显子/内含子连接
区，
也有的扩增子包括启动子区域，或5’/3’非编码区域。在PCR反应之后，可直接
利用DHPLC技术对扩增子进行分析，无需再对PCR产物进行预处理。利用自
动化的DHPLC分离方法，目的扩增子可被彻底地扫描。最后如果DHPLC识别
出含有突变的扩增子，那么就要用测序的方法来确定其突变类型，DHPLC检测
结果没有改变的扩增子无需再进行测序。DHPLC突变检测技术的另一个优点是
可以收集异源双链部分。这些部分含有等量的野生型和突变型等位基因，可为
接下来利用测序方法确定突变类型提供便利。由于在测序前进行DHPLC筛查，
突变检测的总体效率和敏感性得到了大幅度的提高。本文将列举多篇利用
DHPLC技术对生殖细胞系和体细胞系进行突变检测的报道。更多的DHPLC相
关文献可在下面的两个网址中找到：http://www.transgenomic.com
http://insertion.standford.edu前者可通过目的基因和疾病来搜索DHPLC相关
文献，而后者是由Standford基因组技术中心（USA）提供的。
图二：
DHPLC突变检测技术的准确性
迄今为止，用于筛查疾病相关基因突变的方法有很多种。它们包括：单链
构象多态性（SSCP），构象敏感性凝胶电泳（CSGE），变性梯度凝胶电泳
（DGGE），双相基因扫描（TDGS），直接DNA测序，基因芯片分析技术等。
在过去几年中陆续有报道指出，DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更
高的准确性和敏感性[6]。
最近有一项盲性研究，通过对BRCA1基因进行突变筛查，将DHPLC和其
它方法的准确性进行了比较[7]。结果只有DHPLC技术从65个样本中检测到了
全部58种突变，检测结果与测序结果完全相符。这58种突变包括38种单碱基
替换，16种碱基缺失，3种碱基插入和1种插入，缺失复合突变。这项研究证
明了DHPLC技术发现各种基因突变的能力。最重要的是这些突变中的40（71%）
种是以前从未被报道过的，有可能逃脱了其它基因分型诊断方法的检测。这项
研究结果为采用DHPLC技术作为分子诊断方法提供了有力的支持。在另外一
项对整个囊性纤维化（CF）基因（CFTR）的筛查中，DHPLC技术对73个CF
病人的全部CFTR突变的检出率为100%[8]。另外还有一些研究结果表明
DHPLC技术的突变检测准确率达到或接近100%。这些受检基因包括：X-连锁
眼白化病（OA1），威尔逊病（ATP7B），家族性腺瘤息肉病（APC），家族性癌
症综合征（PTEN,RET,VHL），常染色体显性多囊性肾病（PKD1,PKD2），血
友病A(因子Ⅷ)，家族性高胆固醇血症（LDLR），黑色素瘤（INK4A），和退行
性非综合征式遗传性耳聋（GJB2）等。表1中所罗列的是最近利用DHPLC筛
查突变的基因。Stanford基因组技术中心的网址
http://insertion.stanford.edu/dhplc_genes1.html,提供全部或部分利用DHPLC
筛查突变的基因列表，并提供相关疾病和引用文献的介绍。
DHPLC技术最适于对含有大量外显子的基因，以及多基因疾病相关基因进
行突变筛查。这些基因及其相关疾病的例子可在表1中找到，而更加全面的介
绍可在www.mutationdiscovery.com中找到。该网站对遗传突变研究者们免费
提供超过8600个人类基因的基因组DNA序列，以及在这些基因中已检测到的
突变信息。在这些信息基础上，该网站还提供用于筛查这些突变的PCR和
DHPLC的实验方案。
遗传异质性在很多复杂疾病中具有重要的意义，而DHPLC技术是研究遗
传异质性疾病相关基因突变的理想方法。一项关于沙-马-图病（进行性神经性腓
骨肌萎缩）（CMT）相关基因突变的研究报道是对上述观点的最完整的阐述[9]。
作者将利用DHPLC技术对168个CMT患者进行的基因（PMP22,MPZ,GJB1,
EGR2）筛查结果与直接测序的结果进行了比较。所有以前报道过的突变DHPLC
无一漏筛，而DHPLC检测出的某些新突变连测序技术都无法检测出。为了确
定这些新突变，作者通过收集DHPLC异源双链部分，加大了样品中突变等位
基因的含量，从而通过测序确定了突变类型。对于某些多表型疾病，如感觉神
经性耳聋，色素性视网膜炎和外周神经疾病等，DHPLC技术也是一种理想的方
法，因为它们都有大量的疾病相关位点需要进行基因突变筛查。
DHPLC突变检测技术的敏感性：
体细胞基因突变
直到不久以前，直接测序仍然被认为是突变检测的“金标准”。然而现在
基因突变频率低于20%就很难用测序方法检测到，这已是公认的事实[10]。
DHPLC技术是通过区分同源和异源双链来进行突变检测的。这种方法与直接
DNA测序相比更有利于突变等位基因的识别(图1)。已有文献报道DHPLC技术
可从待检样品中检测到占总基因量0.5-5%的突变等位基因，且实验重现性很好
[11，12，13，14]。近来有两篇报道表明DHPLC技术可从发生低水平体细胞遗
传镶嵌现象的结节状硬化患者标本中检测到TSC1和TSC2基因突变，而该种突
变用测序法完全检测不到[11，12]。更深入的研究表明这种基因突变存在于
6-15%的患者的外周血淋巴细胞中。
体细胞遗传镶嵌现象指的是在一个特定器官中出现具有不同遗传性状的多
个体细胞群落。这种现象可由DNA突变，DNA的修饰性改变，染色体异常或
自发性遗传突变逆转等因素引起。这种现象含有孟德尔式和非孟德尔式基因异
常，而它最典型的例子就存在于癌症的发生过程中。Youssoufian和Pyeritz在他
们的文章中对这种遗传镶嵌现象进行了详尽的总结[15]。漏筛这种遗传镶嵌现
象所造成的突变会导致基因突变发生频率的报告不准确，也会使遗传诊断发生
疏漏。而这种现象的筛查对检测肿瘤组织中的体细胞基因突变和异种组织线粒
体DNA中的致病基因突变也是非常重要的。近来有报道表明利用DHPLC技术
可从白血病患者P53基因的外显子中筛查出突变频率低于3%的基因突变[13]。
而在一项利用DHPLC技术对整个线粒体基因组进行突变筛查的研究中，频率
高于0.5%的突变都可被检出[14]。还有许多检测各种肿瘤癌基因突变的文献报
道也对DHPLC技术的敏感性给予了肯定，其中一些研究内容请见表2。
虽然肿瘤是一种遗传病这种观点早已是公认的事实，但特定的DNA遗传改
变和抗癌药物疗效之间存在关联才刚刚被认识到。未知突变的检测对于了解上
述的关联至关重要，而DHPLC正是实现这个目的合适的技术。例如在对肿瘤
发病机制的研究中，在新发现的基因中寻找突变非常重要。Lipkin在文章[16]
中报道利用DHPLC技术，发现一种新的DNA错配修复基因MLH3在25%的
受检结肠癌患者样品中发生了基因突变，而此前的两项利用其它敏感性和准确
性都较低的方法进行的研究都认为MLH3与结肠癌易感性无关。由此可见，
DHPLC技术的
敏感性和准确性确实拥有较大的优势。而Smith在他的文献[17]中报道了利用
DHPLC技术对已知和未知的疾病相关基因进行突变筛查的情况。在这项研究
中，DHPLC技术被用来筛查绝大部分APC和P53基因，因为突变有可能分散
在这些基因中。实验结果表明DHPLC技术作为一种基因突变预筛手段，可以
极大地提高测序的效率。
利用DHPLC技术分析DNA甲基化
DNA修饰性因素（如DNA甲基化等）在基因表达调控中的作用非常重要。
许多看家基因和超过40%的组织特异性基因在他们的启动子区域拥有CpG岛结
构，该结构很容易发生甲基化，从而对基因转录调控产生影响[18，19]。这些
CpG岛结构在发生DNA修饰后，对DNA编码的具体影响还有待证明；但DNA
甲基化与基因沉默之间的确存在关联，这一点可从大多数受测基因（约80%）
中得到证实[20]。而余下的20%受检基因在甲基化后表达水平增强，这些基因都
在第一个内含子或编码区域中含有CpG岛结构。
关于DNA修饰性因素参与癌症发生和发展的证据越来越多，而启动子甲基
化确实对许多肿瘤抑制基因的转录产生负性影响[21]。DNA修饰也与其它许多疾
病有关，例如BWS[22],PWS[23],AS[22]等综合征。环境因素对DNA甲基化有
直接的影响，例如维生素B12缺乏会引起叶酸代谢紊乱，以及DNA甲基化状态的
改变，而在肿瘤组织中维生素水平也会影响DNA甲基化状态[25]。因此检测CpG
岛甲基化对我们了解基因调控与疾病发生发展的关系非常重要。
了解特定疾病过程中甲基化状态的重要性极大地促进了精确描述和量化
DNA甲基化的实验方法的发展。一些常规的甲基化检测方法，如DNA测序，以及
其它基于凝胶和PCR技术的甲基化检测方法，都是费时费力，不适于进行大样
本实验。
而最近有些的报道表明利用DHPLC技术进行甲基化检测可以避免重蹈其它方法
的覆辙[26，27，28，29，30]。
Deng在他的文章[26]中介绍了一种PCR扩增亚硫酸盐修饰的CpG岛，然
后利用DHPLC技术同时检测扩增产物中的CpG岛甲基化和SNP的方法，并用这
种方法对多种细胞系和胃癌细胞系中hMLH1启动子，以及环氧化酶2（COX2）
启动子的甲基化状态进行了检测[26]。这种亚硫酸盐-DHPLC技术可对纯合与杂合
样本中的同源与异源CpG岛结构进行快速的甲基化和SNP检测和定量。这种方
法的另一个优点是在扩增片段中同时检测出CpG位点和SNP。两项相似的实验
都使用甲基化特异性PCR和DHPLC技术来分析三种人类印记基因的甲基化状态，
这三种基因分别是：AS和PWS相关的SNRPN基因，以及BWS相关的LIT1和H19
基因[27，28]。利用这项技术可以在患有PWS婴儿的样品中检测到低水平的细
胞镶嵌现象，这充分证明了该项技术的敏感性[27]。这种变异水平很低的细胞
系（血中低于8%）
用传统的分子生物学方法根本无法检测到。而这种检测低水平细胞镶嵌的能力
对于以遗传镶嵌作为部分显型表现的各种孟德尔和非孟德尔式遗传疾病的临床
诊断和预后有着重要的意义[15]。
另外一种基于DHPLC技术的方法也被用来检测特定位点的CpG岛甲基化
[29，30]。这种方法利用亚硫酸盐处理的基因组DNA的PCR产物，将单核苷酸
引物延伸与DHPLC分离技术相结合，来区分甲基化和非甲基化的CpG岛。而有
些CpG位点是在对引物延伸产物进行多链化之后再进行分析的。利用DHPLC技
术可对特定CpG位点的甲基化进行量化分析。而对于已经明确甲基化对基因调
控影响的特定序列，使用DHPLC技术对其进行分析是非常合适的。
DHPLC在SNP发现和确定研究中的应用
候选基因筛查
人类基因组中众多的DNA多态性以及SNP对基因功能的影响决定了深入
了解候选效应蛋白的遗传变异状况是非常必要的。在构建一个候选疾病基因的
遗传变异图谱时，首先用经典方法确定一个低分辨率的遗传位点，接下来再根
据参照样品（野生型）和各种受检样品建立一个高分辨率的SNP图谱[31]。为
了实现上述目标应该在目的基因区域确定SNP的位置和类型，这需要PCR扩增
基因组DNA,并进行测序分析。但是SNP的实质只是对功能相关研究很重要，
而并非是构建遗传图谱的关键。DHPLC突变筛查技术很好地适应了遗传变异研
究的这一特点，它只检测DNA序列差异，并不确定差异的实质。
利用DHPLC-SNP筛查技术来确定一个功能基因可以采取两种途径[32]。
第一种方法，收集大量的候选疾病基因的样品，然后利用DHPLC对可能发生
功能性SNP的编码序列进行筛查。这种方法的前提是与一种遗传病表现型相关
的基因中应有一个或多个疾病相关的突变位点，因此致病基因突变也应相对频
繁地出现在有相应的疾病表现型的样品中。而上述方法对筛查序列的限制也会
导致漏筛位于非编码调节区域的序列变异。在第二种相对全面的方法中，一个
基因的全基因组序列被系统地进行突变筛查。这样做的优点是在样本量充足的
情况下，漏筛功能性多态的几率较小。上述两种基于DHPLC的方法都能极大
程度上降低SNP筛查的工作量，进而对人类疾病相关遗传位点的构图产生重要
的影响。下面将简要介绍几篇利用DHPLC技术进行SNP筛查的文献报道。
充血性心衰
Lynch和他的同事们在文章[33]中表示充血性心衰（CHF）相关的G蛋白和
下游信号传导通路蛋白的遗传变异信息存在极大的缺陷。在这项研究中，他们
检测了编码信号传导蛋白的基因，以确定新发现的和已报道的SNP的发生频率。
通过DHPLC和确证性双链DNA测序的方法，他们筛查了96-144个CHF病人
的9个主要信号传导基因的56个编码外显子，并且发现了17个新的和8个报
道过的同义SNP,以及一个新的非同义SNP。由于对NCBI和Celera数据库最
初的实验中漏筛了多个SNP很感兴趣，他们又检测了10个已报道过的非同义
SNP，结果在74-91个CHF病人样品中并未发现这些SNP。他们将实验结果与
NCBI和Celera的数据进行比较，发现数据库中56%的SNP并未在他们的样品
中发现，而实验中发现的SNP中的69%并不存在于数据库中。这项研究表明绝
对性地将现有数据库作为多态标记的来源，并只使用这些标记物会导致错误的
实验结果。另外一项最新的研究[34]表明SNP数据库中关于25个G蛋白耦连受
体的数据只有32%能在样本量为60的实验中被确证。这说明利用DHPLC对现
有数据库中的SNP数据进行确证是一种在更大规模实验前对标志物进行评估的
可靠方法。
神经精神疾病
基因编码区的SNP可被用来做关联实验，以确定复杂疾病的遗传基础[35，
36]。而这种实验的成功与否极大程度上取决于疾病相关等位基因的频率以及它
们在不同种族人群中的分布[37]。如果待测序列的高危等位基因频率很低，那么
直接确定突变序列基因型的方法就不适用了。以往对基因的分析表明大多数基
因突变频率很低（<0.05），而且低于75的样本量也会限制检测稀少等位基因的
能力[38]。最近有文献[39]介绍了一项研究，利用DHPLC对神经精神疾病相关
的两个基因的编码区和剪接结合部的突变序列（频率很低）进行大样本量筛查
（n=450）。结果表明这两种基因，SLC6A4（编码5-羟色胺转运蛋白）和SLC18A2
（编码血管单胺转运蛋白），在等位基因变异的数目和频率方面存在明显的差
异。如果将这样的变异基因比较扩展到更大范围的基因中去，那么就有可能确
定特定形式的遗传变异与基因功能之间的关联。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种渐进性神经退行性病变，它是由复杂的遗传和环
境因素共同造成的。一项成功的SNP研究确定载脂蛋白E（APOE）基因（等
位基因4）是一个易感性位点，可能增大迟发性阿尔茨海默病（LOAD）的发病
几率[40]。到目前为止，这是唯一的被证实的LOAD易感性标志。一项最近的
研究对位于12号染色体的编码氧化低密度脂蛋白（LDL）受体1（OLR1）的基
因进行分析[41]。研究者利用DHPLC对50名AD患者的全部OLR1外显子和
内含子/外显子交界部位进行了突变序列筛查。结果有三种新的遗传变异被鉴别
出来，它们全部位于非编码区域。在对超过800个LOAD病例的基因型分析表
明上述的SNP与AD之间存在明显的关联，其中最重要的是位于非APOE4区
域的3’-UTRSNP。关于遗传变异对早发性阿尔茨海默病（EOAD）和LOAD已
有大量报道（见阿尔茨海默病突变数据库
http://molgen-www.uia.ac.be/ADMutations/）。
例如编码淀粉样前体蛋白的基因（APP）和编码早老素的基因（PSEN1,PSEN2）
发生突变会通过改变γ-分泌酶活性一起少见的早发性阿尔茨海默病（EOAD）。
近来一种名为nicastrin(NCSTN)的跨膜糖蛋白被确定是γ-分泌酶复合物的一部
分，而后者可切割淀粉样前体蛋白（APP）[42]。NCSTN被定位于1q23，一个
与LOAD相关的区域。近来有一项研究利用DHPLC对两名荷兰的EOAD或
LOAD患者进行了NCSTN基因突变检测[43]。结果在NCSTN基因中发现了14
种新的SNP，其中之一可能能增大EOAD的发病几率。
心脏病
近来有大量的研究通过对突变序列的鉴别研究各种心脏疾病的相关基因。
家族性肥大性心肌病（HCM）是一种常见的常染色体遗传病，病变部位为心肌
小节。在9种编码肌小节蛋白的基因中发现的突变已经证明与HCM相关[44]。
最常见的突变基因是编码β-肌球蛋白重链的MYH7基因，而功能相关性突变发
生在编码区域的5’端部分。近来有研究利用DHPLC技术来筛查MYH7基因编
码酶解肌球蛋白轻链(LMM)的编码区3’端部分。结果研究者发现了破坏MYH7
基因功能的突变[45]，这说明只有进行全基因突变筛查才能保证正确的诊断。另
外超过1/3的HCM病例没有发现任何突变，无论是在已知的肌小节基因，还是
在与心脏能量稳态相关的其他基因中，结果都一样。利用DHPLC技术对重症
HCM家系的编码AMP依赖蛋白激酶的γ2亚基的PRKAG2基因进行的突变筛
查证明能量耗竭是心肌功能失常的主要成因[46]。近来对HCM致病基因的遗传
异质性的深入研究[44，47]表明扩大对HCM的遗传检测是非常有必要的。
近来还有许多关于其他心肌疾病的候选基因筛查研究。如对位于1q42-q43
的一些疾病相关基因进行DHPLC突变筛查[48]。结果在一个患有致心律失常性
右心室心肌病2（ARVD2）的家系中发现了一种编码心脏ryanodine受体(RYR2)
的基因突变。这些突变的识别为进行症前诊断提供了一个标志物，也为早期监
测和治疗干预提供了机会。这些发现也有可能促成更特异有效的药物干预。
自身免疫病和炎症
另一个焦点研究领域是筛查自身免疫病和炎症相关的基因突变。利用
DHPLC技术，研究者已识别出了多种致病基因突变如PAPA综合征（脓性无菌
性关节炎，坏疽性脓皮病和粉刺），和家族性复发性关节炎（FRA）（一种主要
影响皮肤和关节组织的早发性遗传病）的致病基因突变[49]。而研究者指出这
些突变影响了正常炎症反应的信号传导通路，因此这类自身免疫病有可能与普
通的炎症性疾病如风湿性关节炎，炎性肠病等有相同或相似的病因。利用
DHPLC技术，研究者也在编码胸腺特异性丝氨酸蛋白酶（PRSS16）的基因中
发现了一些SNP，这些基因变异位于HLA复合体中，后者包含有多种免疫疾病
的相关基因[50]。这些基因突变中的一部分有生物学作用，有必要深入研究它们
的疾病相关性（如与糖尿病的关联）。
蛋白水解酶和它们的抑制剂在维持免疫系统稳态过程中发挥重要的作用。
因此这些蛋白的突变形式有可能产生显著的生物学后果。利用DHPLC技术，
研究者在编码丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal-5蛋白（LEKT1）的SPINK5基因中
发现了一组突变，而这种基因是一种常染色体隐性遗传皮肤病Netherton综合征
的缺陷基因[51]。LEKT1是第一个被发现参与免疫疾病的丝氨酸蛋白酶抑制物。
现已发现许多编码与LEKT1类似的丝氨酸蛋白酶抑制物和激活物的基因突变
与疾病相关，如Kazal-1胰蛋白酶抑制物与慢性胰腺炎（CP），以及组织蛋白酶
C与牙周疾病等。
CP是一种严重时可能危害生命的疾病。在过去的几年中，已有三种基因被
发现与CP有关，它们是CFTR,PRSS1和PST1[52]。近来有一项研究利用
DHPLC技术在39个病人中对上述三种基因的整个编码区域和剪接结合部位进
行突变状况的筛查[53]。结果表明约30%的受检者至少有一种基因发生一种突
变。但这不包括新发现的不普遍的基因突变，而这些突变中的一些还有可能具
有功能意义。只有三个病人至少有两种基因中发生了突变。这些少见的病例表
明在CP易感性位点之间存在某种关联。这项研究也提供了一次对一种常见疾病
的不同基因突变的杂合状态进行研究的独特机会。
遗传变异研究在临床治疗中的意义
药物代谢和耐药性
遗传药理学是一种研究基因在个体对药物治疗和环境因素的生物学反应中
所起作用的学科。不同个体对药物反应存在固有的差异，一些常用药物在几种
重要疾病中的作用请见表3[54]。个体对药物的反应直接受个体的基因型和生活
形式的影响。确定个体的基因突变类型无论对科学家或临床医生来说都是一项
艰巨的任务。但是这种研究却可以区别可能与不可能发生药物反应的患者，以
及识别那些可能发生严重反应的高危患者。因此无论从用药的有效性或安全性
来说，对患者进行遗传实验，以预测他对一种特殊药物的反应十分有必要。这
种研究对将带有特定遗传药理学标记的患者分组进行临床实验也有很大的帮
助。
编码细胞色素，甲基转移酶等代谢酶类的基因多态性对药物反应有显著的
影响。这些酶类参与细胞对药物的吸收，分布，降解和清除等活动。因此确定
影响药物代谢的突变等位基因可以帮助临床医生预测患者对治疗的反应。
DPYD
一项介绍DHPLC技术筛查编码二氢嘧啶脱氢酶（DPD）的基因DYPD的
报道证明了识别突变等位基因的遗传药理学价值[55]。这种酶可以催化抗癌药物
5-氟尿嘧啶(5-FU)代谢的限速步骤。DPD缺乏会导致5-FU用药后的严重毒性，
因此在使用5-FU进行化疗之前，确定癌症患者的DPD遗传状态具有重要的价
值。然而DYPD基因的复杂性和大小（23个外显子，150-950kbp）使许多研究
者对研究DPD缺乏的遗传基础望而却步。一项利用DHPLC技术对上述基因的
筛查研究检测到全部21个以前有报道的基因突变，并且鉴别出了纯合与杂合基
因型，证明DHPLC是一种能够准确，敏感，低消耗地检测具有重要临床意义
的基因突变的方法。DHPLC的所有这些特点对于以复杂基因（如DYPD）突变
筛查为目的的病人或自然人群研究是非常合适的
编码TPMT的基因
巯基嘌呤S-甲基转移酶（TPMT）是一种位于细胞质，催化巯基嘌呤S-甲
基化的酶类。巯基嘌呤是一种免疫抑制剂，可被用来治疗急性淋巴细胞白血病
以及风湿性关节炎[56]。编码TPMT的基因多态性对巯基嘌呤的代谢有严重的
影响，目前已有10种影响表型的突变等位基因被识别出来[57]。一种利用
DHPLC快速筛查TPMT相关突变的临床检测方法已经形成[58]。在一项相关研
究中，有98份来自于正在接受或接受过巯基嘌呤治疗的人群的DNA样品被用
来筛查TPMT突变。通过直接测序证实，DHPLC可以鉴别出样品中全部（100%）
突变等位基因。DHPLC对TPMT相关突变的评估是建立在清晰的洗脱结果基
础上的。如果拥有一套参照数据，DHPLC的洗脱结果可被用来预测序列突变的
类型[59]。可见DHPLC这种自动技术可被临床实验室用来确定TPMT等基因
突变的基因型，以及筛查新的突变。
Imatinib
对从事药物研发基础研究的工作者来说，DHPLC是一种有价值的辅助工具。
例如近来有研究表明在对白血病患者的治疗过程中，BCR-ABL激酶激活位点的
基因区域的多种突变对酪氨酸激酶抑制剂Imatinib的耐药性有影响[60]。这项重
要的发现对于确定需要改变治疗策略的耐药性水平有重大意义。Imatinib的其它
目标以及酪氨酸激酶抑制剂的其它作用对象的耐药性机制可能与上述研究结果
相似。最近有一项研究利用DHPLC技术对Imatinib的一个作用对象c-kit进行
了突变筛查[61]。研究结果显示不同时期的胃肠道基质瘤（GIST）都有c-kit基
因突变。这些突变在早期良性的胃肠道基质瘤中存在率较高，这说明c-kit在早
期GIST发展中起作用。重要的是，这些带有突变的GIST类型已被加入了
Imatinib的适用范围中。虽然c-kit并不是GIST由良性转向恶性的标志，但它
却是有用的耐药性指标。可见准确而敏感的对酪氨酸激酶基因靶点的突变研究
能够在不存在类似耐药性的新型抗癌药物研发过程中起到辅助的作用。
VEGF
参与血管生成的基因也是目前深入研究的重要药物靶点。人类血管内皮生
长因子（VEGF）由肿瘤细胞分泌，以自分泌的形式作用于内皮细胞。最近有人
对人类结肠直肠癌中VEGF的基因突变情况进行了研究[62]。结果发现了4个剪
接结合部变异位点和6个新的基因突变。这些突变可能在肿瘤-宿主反应的生物
多样性方面具有重要影响，也可能对药物靶点研究很有价值。
上面这些文献报道为识别和确定与发病危险性，药物反应和耐药性相关的
基因变异提供了理论和应用的介绍。而分析标志等位基因（基因型）和临床特
征（表现型）之间的关系对治疗策略的制定有重要的意义。相信在不久的将来，
对临床相关基因突变的准确识别能帮助医务工作者制定针对每个病人的独特治
疗方案，从而提高对疾病的治疗和控制水平。
总之，近几年来，DHPLC技术飞速发展，利用DHPLC对大量的疾病相关
基因突变进行筛查，如下表：
Table1.Recentgenesassociatedwithinheriteddisordersscannedformutationsby
DHPLC.Transgenomic
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
ABCA4(ABCR)60169150Maculardegeneration〔71〕
ADRB2109690Intron-lessAsthma;chronicobstructivepulmonarydisease;
CHF
〔33··,72〕
ALAP145500-Essentialhypertension〔73〕
ALG3601110-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
ALG6604566-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
APM16054413TypeIIdiabetes〔75〕
APOD1077405Cardiovascular;lipidmetabolism〔76〕
ATPB760688221Wilson’sdisease〔77〕
CFTR(ABCC7)60242127CF;idiopathicCP〔8·,53,78,79〕
CHAC20015073Chorea-acanthocytosis〔80〕
CHX101429935Microphthalmia;anophthalmia〔81〕
CLCN111842523Myotonia〔82〕
CRB160421011Lebercongenitalamaurosis〔83〕
CRX6022253Lebercongenitalamaurosis〔83〕
CPM16035039Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
DPYD274270235-FUtoxicity〔55··〕
DRD21264507CMTdisease〔84〕
DRD31264518Schizophrenia〔85〕
EGR21290102CMTdisease〔9··〕
F8C(FactorVIII)30670024HemophiliaA〔86,87〕
FBN113479765Marfansyndromeandrelatedconnectivetissue
disorders
〔88,89〕
GAD213827517TypeIdiabetes〔90〕
GJB13040402CMTdisease〔9··〕
GJB21210112Hereditaryhearingloss〔91,92〕
GNA111393133CHF〔33··〕
GNAQ600998Intron-lessCHF〔33··〕
GNAS13932013CHF〔33··〕
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
GRIN113824921Schizophrenia〔93〕
GRIN2A13825314Schizophrenia〔93〕
GRIN2B13825213Schizophrenia〔93〕
GRIN2C13825413Schizophrenia〔93〕
GRIN2D60271713Schizophrenia〔93〕
HBB1419003?-Thalassemia〔94,95〕
HFE2352007Hereditaryhemochromatosis〔96〕
HPRP3601850-Autosomaldominantretinitispigmentosa〔97〕
K91442006Epidermolyticpalmoplantarkeratoderma〔98〕
KCNE11762613CongenitallongQTsyndrome(LQTS)〔99〕
KCNE26037961CongenitalLQTS〔99〕
KCNH215242715CongenitalLQTS〔99〕
KCNJ106022082TypeIIdiabetes〔100〕
KCNQ119250016CongenitalLQTS〔99〕
KvLQT1220400-JervellandLange-Nielsensyndrome(JLSN1)〔101〕
LDLR14389018Familialhypercholesterolemia〔102,103〕
LHCGR15279011Leydigcellhypoplasia〔104〕
LIPC1516709Coronaryarterydisease〔105〕
LPL23860010Coronaryatheroscleroticheartdisease〔105〕
MAG15946012Multiplesclerosis〔106〕
MAPK11769488CHF〔33··〕
MC4R155541Intron-lessEarly-onsetobesity〔107〕
MIF1536203Systemic-onsetjuvenileidiopathicarthritis〔108〕
MLC160590812Schizophrenia〔109〕
MPI154550-Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
MPDU16040417Congenitaldisorderofglycosylation〔74〕
MTM131040015X-Linkedmyotubularmyopathy〔110〕
MYH716076039FamilialHCM〔44,45〕
MYOC6016523Openangleglaucoma;ocularhypertension〔111〕
NAB16008007Peripheralneuropathy〔112〕
NAB26023817Peripheralneuropathy〔112〕
NCSTN60525417AD〔43〕
NTF3162660-Schizophrenia〔113〕
OA13005009X-Linkedocularalbinism〔114〕
OPRM16000183Heroinaddiction;idiopathicgeneralizedepilepsy〔115,116〕
PAX610621014Microphthalmia;anophthalmia;coloboma〔81〕
PCDH86035803Schizophrenia〔117〕
PKD16013134Autosomaldominantpolycystickidneydisease
(PKD)
〔118〕
PKD217391015AutosomaldominantPKD〔118〕
PKHD160670267AutosomaldominantPKD〔119,120〕
PMM26010978Carbohydrate-deficientglycoproteinsyndrometype
1A
〔74〕
PMP226010973CMTdisease〔9··〕
PRSS12760005Hereditarypancreatitis;idiopathicCP〔53〕
PRSS1660716912Autoimmunity〔50〕
PTPN1117687614Noonansyndrome;:ROPARDsyndrome;
Cardiofaciocutaneoussyndrome
〔121,122〕
RAB3A1794905CHF〔33··〕
RAB41795118CHF〔33··〕
RAB5C6040375CHF〔33··〕
RAD1795038CHF〔33··〕
RPE6518006914Lebercongenitalamaurosis〔83〕
RPGRIP160544615Lebercongenitalamaurosis〔83〕
SIX36037142Microphthalmia;anophthalmia;coloboma〔81〕
SLC6A418213813Anxietydisorders〔39··〕
SMN16003548Spinalmuscularatrophy〔123〕
SPINK11677904IdiopathicCP〔53〕
SPINK560501028Nethertonsyndrome〔51〕
SUOX2723003Sulfocysteinuria〔124〕
TGM219019613Maturith-onsetdiabetes(MODY)〔125〕
TNFRSF1A19119010Tumornecrosisfactorreceptor-associatedperiodic
syndrome
〔126〕
TSC160528421Tuberoussclerosis〔11·,127〕
TSC219109241Tuberoussclerosis〔11·,12·,127〕
VHL1933003Hippel-Lindaudisease〔128〕
WFS16062018Wolframsyndrome〔129〕
Table2.CancergenesrecentlyscannedformutationsbyDHPLC.Transgenomic
GeneMIM
number1
ExonsDiseaseReference
APC17510015Colorectalcancer〔17··,130-133〕
ATM20890062Hereditary,sporADIcbreastandovariancancer〔134〕
AXIN160381610Hepatocellularcarcinoma〔135〕
AXIN26040252Hepatocellularcarcinoma〔135〕
BRCA111370523Hereditarybreastandovariancancer〔7·,136,137〕
BRCA260018528Hereditarybreastandovariancancer;sporadic
exocrinepancreaticcancer
〔136-138〕
CDH119209016Hereditaryprostatecancer;sporadicductaland
lobularbreastcancer
〔139,140〕
CTNNB111680616Uvealmelanoma;hepatocellularcarcinoma〔135,141〕
DBC2--Breastcancer〔142〕
ELA2(NE)1301305Lungcancer〔143〕
FAM10A4606796-B-cellchroniclymphocytesleukemia〔144〕
?-GCS--Lungcancer〔145〕
GSTP11346607Lungcancer〔145〕
GSTM11383508Lungcancer〔145〕
GSTT16004365Lungcancer〔145〕
INK4A6001603Melanoma〔146〕
KIT60676421GISTs〔61··〕
K-ras6015996Colorectalcancer〔17··〕
MET16486021Papillaryrenalcarcinomas〔147〕
MLH112043619Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer;
endometrialcaricinoma
〔148,149〕
MLH360439513Colorectalcancer〔16·〕
MSH212043516Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer;
endometrialcaricinoma
〔148,149〕
MUTYH60493316Hereditarynonpolyposiscolorectalcancer〔132,133〕
MYO18BLungcancer〔150〕
NBS160266716Acutelymphoblasticleukemia;colorectal
carcinoma
〔151〕
P14(ARF)6001603Uvealmelanoma〔141〕
P15(INK4B)6001603Uvealmelanoma〔141〕
P16(INK4A)6001603Uvealmelanoma〔141〕
PTEN/MMAC16017289Endometrialcarcinoma;neuroblastoma〔148〕
RNASEL1804356Prostatecancer〔152〕
SMAD460701013Uvealmelanoma;pancreaticcancer〔141〕
TGFBR21901827Uvealmelanoma〔141〕
TP53(p53)19117011Variouscancers〔13,17··,141〕
耐药性相关基因突变的微生物学识别和检测
随着耐药性微生物的大量出现，针对传染性病原体的治疗策略制定和药物
研发变得越来越难。抗微生物治疗面临挑战的一个重要原因就是缺乏能够准确
识别致病微生物和耐药基因的有效临床手段。然而近来发展起来的能识别病原
体和研究微生物抗药性的分子生物学方法又为抗微生物治疗和药物研发建立了
希望。下面将对利用DHPLC技术，成功识别致病细菌以及细菌耐药性基因突
变的研究进行简要的总结。
从临床治疗的角度来看，准确确定致病微生物的种类具有重要的价值，它
可以保证用药的有效性。Hurtle在他的文章[63]中指出DHPLC技术能有效的识
别病原微生物。作者利用万能PCR引物从多种细菌的转录16S核糖体RNA的
基因中产生出一条320-bp的扩增片段。将这些来自不同种类细菌的扩增产物与
参照物混和后进行DHPLC检测，会产生一个独特的色谱结果。而该结果可以
作为鉴定细菌种类的分子指纹。
在一场大范围疫情爆发中，从菌株水平确定病原菌是至关重要的。只有了
解了致病菌株才能正确选择抗菌药物。Shlush等指出将PCR,DHPLC和多位点
序列分型（MLST）技术相结合可以从菌株水平识别病原菌[64]。MLST技术利
用位于非连锁位点的管家基因来进行微生物分型[65]。研究人员PCR扩增管家
基因区域，并将扩增产物与对照物混和。通过DHPLC检测，产生每个管家基
因的特定的色谱结果[64]。实际上DHPLC的分析能力在没有测序的情况下远远
超过MLST。
对已知和未知的耐药性基因突变的检测对于评估现有和新开发的抗生药物
至关重要。而DHPLC可以准确地检测耐药性相关基因突变。一项筛查肠炎沙
门菌抗quinolonegyrA基因突变的研究[66]表明，在准确性方面，DHPLC远远
超过了其它检测单碱基突变的分子生物学方法，如单链构象多态性，和轻环
PCR-gyrA杂交突变检测技术(GAMA)等。Hannachi-M’Zali也在文章中[67]指
出DHPLC是检测甲氧西林耐受的金黄色葡萄球菌的抗quinolonegyrA，gyrB,
grlA和grlB基因突变的有效方法。而Cooksey则利用DHPLC技术建立了抗结
核药耐受性相关基因突变筛查的常规方法[68]。上面的研究表明将DHPLC与其
它分子生物学方法结合使用，可以了解引起耐药性的基因突变，从而促进特异
性药物的研发。
DHPLC技术在微生物学研究中的应用并不仅限于细菌相关的工作。它也可
被用在真菌，病毒和寄生虫等研究领域，以识别微生物和检测抗药基因突变。
使用DHPLC技术对抗生药物的研发由三点益处。第一，DHPLC技术可以可靠
地从种属和菌株水平识别微生物，弥补传统的表型识别方法的缺陷。第二，
DHPLC技术可以高度准确地检测耐药基因突变。第三，DHPLC技术具有从混
合微生物群落中识别突变种类的能力。从异源混合物中检测遗传突变基因对于
监测感染过程中病原微生物耐药性的变化至关重要。上述观点的一个重要例证
是人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的进化过程[69]。在活体标本中发现了由主要HIV-1
蛋白酶基因和少数突变基因组成的复杂的病毒准种。在没有选择压力的情况下，
耐药突变基因的出现频率低于野生型基因。而抗药选择可以使这种突变基因成
为主要基因型。这种关于HIV-1病毒准种的分析可使研究者深入了解病毒进化
过程中病毒群落的复杂变化。但是这种病毒群落的分析是一项艰巨的任务，因
为低频率的突变很难通过测序检测到，亚克隆病毒PCR产物的测序结果会偏向
频率高的突变类型[70]。DHPLC等技术能提高检测少数耐药突变的能力，进而
促进HIV-1等传染病的治疗。
结论
由于准确，敏感的DHPLC突变检测技术的发展，新发现的基因突变数目
正在快速增长。DHPLC突变检测技术对人类疾病发生，易感性和治疗相关基因
突变以及连锁标志物的识别做出了重要的贡献。由于环境，生物学和进化因素
等不同选择机制的使用，新发现的遗传等位基因将越来越多。而发现与肿瘤基
因，病原微生物的病毒因素，以及特定药物靶点相关的新的低水平的基因突变
将是一项持久性的任务。采用DHPLC技术筛查基因突变，将会使这项任务更
好地进行，并促进高效的药物研究和开发。
致谢
在此我想感谢DrsJosephBreen,GeorgeHong,PhillipEastlake,Felix
Frueh和MarioNoyer-Weiner等对这篇文章的创作所付出的饱含思想性的努
力。我也想感谢AmandaMiller-Lindholm和CarlaShaw-Bruha对表1，2的制
作所给予的帮助。
参考文献

属于的，基因测序属于体外诊断，一般的样本可检测唾液，血液，组织细胞，口腔上皮细胞等等，都是在体外进行PCR检测的，所以做基因检测所需要的试剂 和试剂盒都是体外诊断试剂

如果选择系列产生在行，就是这一行有几个数，就会产生几个系列，每个系列的数据就是每行对应的列里的数据。

Illuminamiseq测序是不是只测DNA的5到3方向的单链，而3到5在簇单链生成的时候被去掉了？是在rd1和index测序之前只有3到5单链共价结合在flowcell上？

本人刚接触二代测序不久，因此对于测序定量这方面存在一些问题，希望大神们能帮助解一下，谢谢！！

我们使用的仪器是Illumina公司的nextseq500。在混样前会先进行荧光定量PCR（ABI7500），我一般是将文库稀释到4ng左右，稀释10000倍进行定量

1.同一批构建的同一种类型的文库，在定量时会有个别文库定量结果不准，复孔没问题（依据是我已将文库稀释到同样的ng数进行定量，所以得到的pm数应该在一个接近的范围内，但有的样本差异比较大），这种情况我一般会根据qubit定量将定量不准的个别样本参考其他样本的浓度进行稀释，下机数据量确实与校准的结果一致，说明应该是荧光定量的问题，这种情况在几种类型的文库中都有发生，文库一般在400bp左右。想问下这种情况是属于定量的问题还是文库自身的问题。

2.按照荧光定量的结果进行混样然后上机，每次我们混合后的文库都会进行qubit定量，大概会有一个上机参考值
（前提是不含有大片段的文库），但qubit值接近的文库上机的clusterdensity却相差很大，这是什么原因造成的？不同项目的文库会有影响，但我们文库的片段大小基本一致。有什么好的办法解决么？

3.最近按照荧光定量的浓度混合的文库上机，数据量总会超过预期很多，致使Q30很低，影响数据质量，采用的是7500机器，KAPA的定量试剂盒，机器才校准过，会不会是测序仪自身的问题？如果不是我们应该如何解决？

4.我们一般采用中通量测序盒子，大概每次上机在30个文库左右，数据量分配有时差别比较大（500M-8G），这样分配数据量可以完全按照荧光定量的结果分配么，数据量大的文库会不会成簇效率更高一些，使数据量小的文库得不到相应的数据量了？

5.除了2100和荧光定量这两种方法，还有什么其他的方法可以评价文库质量么？

6.现在上机文库得到的数据量有时与预期偏差较大，问题都在定量混合这块么？还有什么其他地方可能有问题么？

二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变，而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。本文对二代测序领域的最新进展做了小结，其涉及的公司包括454LifeSciences,Illumina,LifeTechnologies,PacificBiosciences,OxfordNanopore等。

自从哈佛大学遗传学家GeorgeChurch和454LifeSciences公司JonathanRothberg掀起二代测序NGS的**以来，已经过去了将近十年。毫不夸张地说，这段时间以来NGS技术已经发生了翻天覆地的变化，在测序通量突飞猛进的同时，测序成本直线下降。
想当年454LifeSciences公司测序580-kb的细菌基因组，需要四小时的工作循环。而今年一月份Illumina公司发布的HiSeqX?Ten测序系统，能够以千元成本测序完整的人类基因组，最多每天能测序600billionbp。
如今，二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此，基因组学ArchonX奖（ArchonGenomicsXPrize）不得不于去年八月宣布取消，因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。
Church的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一，他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何，既然竞赛已经启动，总得让人家比完吧。
言归正传，二代测序领域的2013年既忙碌又喧嚣，在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。
454LifeSciences
去年十月，454LifeSciences宣布将于2016年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器，GSJunior和GSFLX+。据该公司介绍，从扩展性和成本角度看，454平台作为首个商业化的NGS系统已经基本上走到尽头，很难再对其进行升级和改良。Roche的BethButton指出，公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013年9月，该公司宣布与昔日的竞争对手PacificBiosciences合作，拟基于PacBio公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。
Illumina
今年一月Illumina公司发布了两个以Solexa测序技术为基础的新测序平台，HiSeqXTen和NextSeq?500。
据该公司的新闻稿介绍，定价$250,000的台式NextSeq500兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作，可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组。”NextSeq500运行75个测序循环只需12小时。
HiSeqXTen系统以10台仪器为单位销售，据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价1000万美元，能够在三天时间内生成1.8terabases的数据，相当于每天约600Gb，比HiSeq2500强十倍。
华盛顿大学的ElaineMardis表示，HiSeqXTen系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业，因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本，就需要正确的样本量，”她说。当然，高通量还意味着更为复杂的数据分析。
Mardis的团队曾作过计算，为了跟上HiSeqXTen他们可能需要花费八百万美元在信息学设施上。此外，实现千元成本意味着每年需要测序18,000到20,000个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组，”她说。“但数量还远远不够。”
LifeTechnologies
已被ThermoFisher收购的LifeTechnologies拥有两款NGS平台，SOLiD和IonTorrent。据Thermo的AndyFelton介绍，公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到Ion上，”他说。
目前的IonPGM系统可使用最新的Ion318芯片，产出多达6million400bp的读取，也就是说四小时运行的产量能达到2Gb。而新IonProton?使用IonPI?芯片，能够产出80million200bp的读取，即每次运行产量达到10Gb至14Gb。
据介绍，今年公司将会推出用于转录组测序的新IonPII芯片，每张这样的芯片可产出300million100bp的读取，随着系统改良甚至可能达到200bp。
此外，LifeTechnologies公司正在研发一种新的聚合酶，Hi-Q。据Felton介绍，Hi-Q能“显著提高精确性”，减少90%的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化。
PacificBiosciences
PacificBiosciences公司以长读取的二代测序技术著称。据该公司的创始人SteveTurner介绍，在新测序化学P5-C3的帮助下，如今PacificBio的测序读长已经达到了8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”，可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触，避免酶受到潜在的光学损伤。
“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤，我们相信现在测序读长受到的限制，只来自于样品本身，”Turner说。样品本身的限制是指，读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板，而这样的缺口会导致测序过早中止。
目前PacBio®RSII和SMRTCell系统，每次运行可产出50,000个读取（约400millionbp）。这一数字会在接下来的一年中继续增涨，Turner说。“我们预计在2014年内，令测序读长再增加50%，并于2015年达到20,000bp。”
最近研究人员发表文章向人们展示，在新装配方法HGAP的帮助下（hierarchicalgenome-assemblyprocess），可以实现只利用PacBio化学法对真核基因组进行从头装配。一月份，该公司公布了对黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）进行的完整二倍体基因组装配，生成了长达24.6Mb的重叠群（contigs），N50值为15.2Mb（N50值反映了重叠群的长度）。就在上周，PacBio公司又公布了一个54x覆盖度的单倍体人类基因组装配，生成了“3.25Gb的基因组装配，重叠群N50值为4.38Mb，其中最长的重叠群达到44Mb。”
OxfordNanopore
OxfordNanopore公司无疑是纳米孔测序的领导者，这一技术也被称为第三代测序。该公司去年十月份宣布，将在2014年年初推出USB大小的MinION?测序仪，为客户提供先期体验（early-access）。
与其他类似先期体验项目不同的是，OxfordNanopore公司不会局限于传统的测序中心，而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。
OxfordNanopore公司强调，不是每个MinIONAccessProgram（MAP）申请者都会在第一轮受到邀请，而且公司提供的MinION数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。
2012年，OxfordNanopore公司在AGBT上描述了两个测序系统，MinION就是其中之一，另一个产品是GridION?。据公司发言人称，MinION的大小使其更容易受到人们的关注，它的灵活性和测序能力将推动NGS进一步迈向普罗大众。
OxfordNanopore公司希望通过MinIONAccessProgram评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的GridION先期体验项目，不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。
广泛的应用前景
在二代测序技术不断进步的同时，它的应用也越来越广泛。据Mardis介绍，二代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择二代测序的多基因panel对肿瘤进行研究，或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时，人们也逐渐抛开了传统的诊断方法，转而使用全外显子组测序。
Mardis补充到，NGS检测有两大优势，它既可以帮助人们确定治疗方案，也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上Church认为，用二代测序进行（致病基因）携带者筛查，是NGS的“杀手锏”。
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因，”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因，现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。”
最近，Church作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍，这是首次发表用NGS进行携带者筛查的文章，他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针，在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因，其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。
二代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞RNA测序。“单细胞RNA测序能向我们展示，相同细胞中RNA表达的天然随机性，这一点非常吸引人。”Mardis说。
Church介绍到，他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案，称为荧光原位测序（fluorescentinsitusequencing）。这一技术将荧光原位杂交和RNA-Seq结合起来，能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。
Church的团队通过荧光原位测序证实，转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。（Science禁止透露进一步的细节）
这样的数据在十年前简直难以想象。同样，我们也很难想象NGS在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。
来源：生物探索

佳学基因测序全部使用进口高质量试剂，以保证质量。

DNA测序的测序原理：
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。
另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

来源：高特佳投资/李新颜2015-09-2310:10
导读
2015年将成为我国精准医疗的元年，基因测序作为精准医疗的前端，行业面临爆发性的增长机遇，同时在实际操作中也面临一定的挑战。
第一部分：基因测序被关注的原因
测序技术和大数据分析能力的发展使得精准医学成为可能。精准医学是以患者的个人基因组信息为基础为病人量身设计出最佳治疗方案，和传统的循证医学相比，精准医学有望成为治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。
1.1基因测序的价格以超摩尔定律下降，使得基因测序经济性推广成为可能
现在人类全基因组测序成本已经降到1000美元以下，未来这一数字还将继续下降；
2008年，二代测序技术NGS的出现和推广，让测序成本开始加速下降，并明显超过摩尔定律的预测。
基因测序技术成本迅速下降（每兆碱基）
1.2大数据分析工具的出现和进步，使得基因测序能够进入现实应用领域
针对大量基因组数据，大数据处理能力提升也为分析和解读基因数据提供支持，测序技术及大数据分析能力的不断提升将会推动精准医学进入快速增长的轨道。
1.3传统医学需要突破，精准医疗的政策风口助推基因测序发展
政策风口：2015年2月，习近平总书记批示科技部和国家卫生计生委，要求国家成立中国精准医学战略专家组。
2015年3月11日，科技部召开国家首次精准医学战略专家会议，并决定在2030年前在精准医疗领域投入600亿元。2015年1月，国家公布了产前筛查与诊断高通量测序试点单位，4月公布了肿瘤诊断与治疗高通量基因测序试点单位，表明了政府推动精准医疗发展的决心。
5月14日，国务院颁布《关于取消非行政许可审批事项的决定》，再取消49项非行政许可审批事项，不再保留“非行政许可审批”这一审批类别。与医药相关的包括：第31项：第三类医疗技术临床应用准入审批；第52项：国家食品药品监督管理总局负责的药品行政保护证书的核发。取消非行政许可审批，松绑第三类医疗技术临床应用，变事前审批为事中事后监管。预计未来，由省级卫生计生行政部门负责的第二类医疗技术实施准入审批也将逐步取消。轻审批，重监管的趋势明确。
第二部分：基因测序的特点及发展趋势
2.1、二代测序仍然是基因测序最主流的技术
目前基因测序技术已经发展到第三代（也有把纳米孔外切酶测序成为第四代）。
第一代DNA测序技术用的主要是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法。
第二代DNA测序技术（NGS）目前使用最为广泛，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa，Hiseq技术和Life公司的Solid技术为标志。
第三代DNA技术（TGS）以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies的纳米孔单分子测序技术为代表，测序过程无需进行PCR扩增。
二代测序在5-10年内仍然是基因测序的主流方法
二代测序技术凭借其高通量、低成本和高准确度取代第一代测序技术成为测序市场的主流。由于第三代DNA测序技术目前面临测序成本高和测序结果准确度相对较低的市场化瓶颈，因此TGS仪器大规模商业化仍然需要较长的时间。
NGS各环节对测序结果有重要影响：NGS测序流程包括样本收集、基因提取、文库构建、基因测序和数据分析，各环节的准确性对测序结果有重要影响，比对数据库的规模直接影响数据分析结果的准确性。
2.2、二代测序技术可能成为未来分子诊断的核心平台
二代测序技术兼具通量和准确度优势，有望引领分子诊断方法革新
常用的分子诊断技术包括聚合酶链式反应（PCR）、转录介导的扩增（TMA）、荧光原位杂交（FISH）、基因测序、以及基因芯片技术。
基因检测主要技术的细分市场增速概况（全球）
分子诊断仪器产品的研发，瓶颈不在于技术而在于政策对创新产品的鼓励，国家目前已开辟创新通道，受理审批周期也在大大的缩短。
不同发展阶段的分子诊断技术都有其特定的应用场景，随着NGS成本的下降，商业模式的丰富，传统的分子诊断方法将受到挑战。二代测序技术兼具通量和准确度优势，更为快速、低廉，极大地拓宽了基因测序的应用范围，尤其促进了分子诊断方法的革新。
第三部分：基因测序产业格局投资机会及挑战分析
3.1基因测序产业格局概览
基因测序市场的细分领域，包括了仪器、耗材、测序服务、数据处理、终端应用等多个方面，如下图所示。
上游：仪器试剂耗材
中游：测序服务（样品制备、检测和分析），信息分析（大数据存储、解读、共享）
下游：终端用户（应用场景）
3.2上游：仪器技术壁垒最高且形成寡头垄断格局，试剂耗材国内企业有一定机会
二代测序市场主流测序平台主要是四大家：Illumina、IonTorrent/LifeTechnologies(2014年被ThermoFisher收购)、454LifeSciences/Roche、PacificBiosciences。
Genomeweb2013度年全球测序仪器市场调查显示：Illumina占据了全球测序仪器市场71%的份额，Lifetechnologies则排名第二分得16%的市场份额，罗氏和PacBio则以10%和3%分列第三和第四位。前两家测序仪公司的全球市场占有率接近90%，基因测序仪行业已经形成寡头垄断的格局。
国内的三大家华大基因、达安基因、贝瑞和康和仪器供应商合作，已经在仪器和试剂层面均获得注册证。从盈利模式角度看，仪器未来不排除出现免费赠送，主要赢利点从试剂耗材及服务端获得，因此国内企业在试剂和服务端突破的可能性最大。
测序试剂、耗材、检测项目的开发，国内企业已经开始有所布局。
2014年7月，华大基因的新一代测序产品也获得了CFDA的批准，包括BGISEQ-100、BGISEQ-1000，以及胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）检测试剂盒。
2014年11月5日，国家食品药品监督管理总局批准了达安基因的基因测序仪和胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒（半导体测序法）医疗器械注册。
2015年4月，贝瑞和康的基因测序仪（NextSeqCN500），以及胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21）检测试剂盒已通过国家食品药品监督管理总局（CFDA）的批准。NextSeqCN500基因测序仪是贝瑞和康与Illumina公司合作，为满足中国临床需求而设计制造的一款新型高通量的基因测序仪。
3.3中游：第三方测序服务机构和生物信息分析（数据分析），数据分析是目前行业发展的瓶颈环节
Illumina推出HiSeq系列高通量测序仪后，终端的数据分析成为行业发展的瓶颈。由于数据库是决定检测比对结果准确度和精确度的重要因素之一，因此是数据分析软件提供商主要的竞争壁垒之一。
测序服务——中国成为全球“测序工厂”
测序服务技术壁垒较低，主要面向科研市场，国家缺乏准入标准和质量控制规范，众多碎片化的小企业呈现疯狂生长的状态，仅提供一代测序服务的企业就有上百家。
在二代测序方面，2010年高通量测序平台中国拥有量仅次于美国，如今二者的差距很可能已经非常小。
全世界规模最大的基因组研究中心有多个在中国，其中华大基因（BGI）拥有世界上最多的新一代测序仪，产能约占全球的10%-20%（按illumina，Life等销总量计算）。
国内主要第三方基因测序机构覆盖的基因检测相关服务
测序服务本身壁垒较低，未来会出现超大规模的第三方检测工厂，出现基因测序界的富士康，实现规模效应。
科技服务仅约10亿元的外包市场，企业未来转型的出口是健康管理、医院、独立体检中心。因此有越来越多的科技服务测序公司在转向做第三方医学检验所。
临床测序有三个主体，第三方医学检验所、医院和体检中心，前者更加市场化，未来发展空间较大。
生物信息分析——挑战与机遇并存
基因测序所生成的原始数据并不能反映任何有价值的信息，必须通过专业人员进行分析和解读。现今的生物信息分析涉及的数据存储、解读、及共享是整个基因测序行业目前面临的最大难题，主要原因一是来自于数据量的庞大，二是源于数据的复杂性。
目前这一市场份额基数较小，蕴含着巨大的市场潜力。关注国内企业在这方面的的机会。
数据解读已被全球公认为是比测序还要重要的环节，分析和解读可能会成为中国企业的优势。但短期只能烧钱看不到回报，门槛是数据库，这是限制企业数量和规模的主要原因。
生物信息的所有权和应用领域，目前仍以科研为主，商业化应用瓶颈在于伦理和政策，但随着市场培育的加快，政府和保险的参与，基因组信息未来将归个人所有，政府负责建立数据中心和安全中心，授权个人对数据的使用权。
数据解读服务的市场格局将分为两大阵营：（1）、自行解读，有仪器研发和实力较强的大企业或科研机构会自己解读；（2）外包解读，中小企业、科研人员、医生个人则会交由第三方公司进行数据分析，因此市场对差异化的个性化的服务需求会增加，此类公司会越来越多。外包解读将催化产业不断涌现出各种创新服务模式。
至于数据库的建设，更看好通过市场化的竞争，由企业投资整合资源来积累数据的途径。
解读服务发展的催化剂在需求，落脚点在市场教育。数据库如果不用那就只是个数据库而已，没有附加价值。而医生和患者认识的基因越多，到更大平台去解读和挖掘数据的需求就越大，想要发现已知或未知疾病机理的欲望就越强烈，未来买单的将是保险公司。
3.4下游：二代基因测序的应用领域及其挑战
3.4.1未来市场容量
根据Illumina的测算，基因测序的市场规模有200亿美元左右。
其中，肿瘤学120亿美元、生命科学50亿美元（包括生命科学工具、复杂病症，农业基因以及影响因子和宏基因组）、生育和基因健康20亿美元（孕妇和新生儿童的检测，以及基因健康）、其他应用10亿美元。
目前，我国基因测序市场中，产前基因检测较为著名，如以国家规定的3500元/次的费用计，按照我国每年2000万左右的新生儿计算，产前基因检测市场能达到七百亿元人民币。
具体来看：
生育健康领域（应用相对成熟）
新生儿出生缺陷不仅给家庭带来了沉重的复单，而且已经成为严重影响我国经济发展和人口素质的重要问题。一些特定的遗传性疾病往往在出生一定时间后才会表现出明显症状，因此初生儿早期的基因筛查能够帮助尽快在医学上进行早期干预，达到及早发现、及早治疗的效果。目前新一代测序技术在生育健康领域主要应用在以下方面。
●无创产前检测（NIPT）
无创产前检测即胎儿染色体非整倍体无创基因检测，是一种基于大规模平行基因组测序技术的高科技检测手段。这种检测只需抽取孕妇少量静脉血，分离其中的胎儿游离DNA，通过高通量二代测序技术平台测序，并对测序结果进行生物信息学分析，即可判断胎儿是否换染色体非整倍体疾病。该技术是国际人类基因组学研究成果被成功孵化的应用技术之一，在欧美等发达国家普遍开展。该法操作简单，易行，安全，准确，孕妇早期就可进行，更具有无创的特点，不会导至流产、胎儿宫内感染等不良后果。
无创产前检查不仅可以筛查唐氏综合症（21三体），还可以筛查爱德华氏综合症(18三体)、帕特氏综合症（13三体）以及提示其他非整倍体型遗传病。
●胚胎植入前遗传学诊断（PGD）
也就是第三代“试管婴儿”，主要用于检查胚胎是否携带具有遗传缺陷的基因。它是在试管婴儿技术基础上出现的，精子卵子在体外结合形成受精卵并发育成胚胎后，在其植入子宫前进行基因检测，以便使试管婴儿避免一些遗传疾病。通过DNA检测技术对胚胎的染色体异常或者遗传性疾病进行诊断，选择无异常的胚胎植入母体，从根本上提高“试管婴儿”的妊娠成功率，降低自然流产率，提高妊娠质量，并且可大大提高出生后婴儿的质量。
●新生儿单基因遗传病检测
单基因病是指由一对等位基因控制的疾病或病理性状。常见的单基因病有短指症、地中海贫血症、白化病、苯丙酮尿症、色盲、血友病、C6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）缺乏症等。已知的单基因病的致病基因及遗传方式大部分已经明确，早起单基因遗传病大部分通过染色体核型分析进行检测，染色体和性分析不可避免的缺点是分辨率低，对技术人员的经验依赖度高，对于微小缺失或者基因突变导至的遗传病不能进行检测。现在通过先进的二代高通量测序技术可以对上千种由于基因变异（基因突变、平衡异位、微缺失等）导至的遗传病进行检测，并且可以在早期通过胎儿的脱落细胞或者绒毛膜进行检测，在产前确认胎儿是否患有遗传病，为遗传病携带者或者已经生育遗传儿的家庭提供明确的遗传咨询和产前检测，从而做到优生，提高人口素质。
肿瘤的个体化治疗
肿瘤的发生发展中，基因的改变在其中居于中心地位，致癌基因的异常表达和抑癌基因失活，是肿瘤细胞无限制生长的分子基础。肿瘤临床表现多种多样，且发病率逐年升高，迄今尚无简单的治疗方法或使用单一药物能治愈所有的肿瘤。询证医学、诊疗规范化和个体化已经成为肿瘤治疗的公认趋向。
基因测序技术对于肿瘤个体化治疗主要有两方面应用：一是检测患者携带的肿瘤基因，二是检测肿瘤靶向药的靶点。
药物研发领域应用（CRO及医药公司）
新一代测序技术早期主要应用在肿瘤和传染病治疗领域，现在越来越多的使用在新兴生物药的开发和疫苗生产。目前药物研发部门使用的各种高通量技术，例如基因芯片、代谢组学建模、酵母双杂、蛋白质组学、高通量化学筛选、电子杂交定位，有望被新一代测序技术替代或作为补充。
个人DNA信息咨询
近几年兴起的直接面向用户（directtoconsumer）的个人DNA信息咨询产业其实是基因检测市场化产物，基本模式是利用互联网和快递寄送，将检测试剂盒送至用户手中，再由其将采集的唾液及送回公司，并从中提取用户的DNA，检测结果也可直接从网上查询获取。
3.4.2在应用领域主要趋势及挑战
业界认为，基因测序技术应用市场的先后顺序：无创产前筛查（NIPT）、癌症的个体化用药、癌症早筛、人人基因组、检测与筛查。
其中，植入前胚胎遗传学诊断（PGS/PGD）30亿市场、产前筛查与诊断（NIPT）160亿市场、肿瘤诊断与治疗千亿市场。此外，目前已经试点的方向，并不能说明技术已经很成熟，相反有些还很不成熟，需要通过很长时间的试点来积累样本和数据。未来可能的试点方向包括，免疫系统疾病、移植类疾病配型检测、传染病检测、公共卫生领域等都有可能。
生育健康领域
NIPT作为公认的第一个产业化项目，市场格局基本形成华大和贝瑞占90%的市场份额，包括108家试点单位及其他中小医院。
NIPT进入壁垒目前只是渠道
1、测序成本和客户体验，如果成本降到目前的1/10，或客户体验有颠覆性改变，都能形成替代，但短期还看不到；
2、测序服务上，主要是产科医院的渠道壁垒。
肿瘤诊断领域
目前的第二大应用，未来有可能成为第一大应用领域，个性化用药、靶向治疗、早诊是必然的发展方向，空间很大，但短期内还达不到无创的市场高度。
（1）肿瘤是多基因病，没有标准的用药方案，需要个性化治疗，并且机理尚未厘清，医院更倾向于自己做，不容易商业化。
（2）从基于组织到基于血液的肿瘤诊断，对医生而言需要有至少五年的市场培育过程，病种的增加则受制于样本量的积累。
（3）肿瘤的早诊，技术上，血液循环肿瘤细胞DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞（CTC）目前通过测序的检出率还很低，需求取决于人们保健意识的发展程度，未来可能成为健康保险的一个重要产品。
其他
其他应用领域主要的挑战：耳聋基因的筛查（检出率低，假阴性高）、罕见病筛查（无有效干预手段）、地中海贫血、靶向药物伴随诊断（尚无标准）。
2C端的应用的挑战，需要有一个较长的市场教育和科普过程，并且受限于伦理和法律。（生物谷Bioon.com）