公司背景:SICGEN抗体是一家葡萄牙生物技术公司,专门研发和生产用于生命科学研究的抗体。公司利用尖端技术,以最优的质量和最具竞争力的价格,致力于成为世界多克隆抗体及抗体相关产品和服务的提供商。它既是一个产品公司也是一个服务公司,它的主要业务是发现和销售用于研究和科学目的的新抗体。多年来,SICGEN一直为国内外主要大学、科研机构、制药企业和生物技术公司生产定制的多克隆抗体。
Biotechrabbit为诊断、生命科学研究与应用市场创新、开发和生产性能卓越的分子生物学产品。所有的开 发、生产与物流均在我们的柏林工厂进行。分子生物酶及蛋白的生产是Biotechrabbit的支柱业务。我们采用高密度原核与真核发酵,之后以数道经过精确调整的纯化步骤生产高纯度蛋白,可进行小样和大规模生产。研发部门由经验丰富的科学家及业务开发人员组成,重点关注客户及合作伙伴的需求。我们的团队专心致力于提供用于分子生物学领域的顶级品质产品。
对单一和多重靶标均具有同类最佳性能
在病原体检测方面具有高度特异性的便捷预混液
对低丰度DNA靶标高度灵敏
BiotechrabbitCAPITALqPCR ProbeMix预混液用于对基因组、CDNA和病毒序列进行定量分析,在单一和多重qPCR方面都具备卓越的性能。该预混液的高灵敏性非常适合于诸如病原体检测等应用中检测低丰度DNA靶标。
涵盖宽广线性范围的准确定量。通过在非模板质控品中进行qPCR测定评价灵敏性、特异性及是否无非特异性扩增。使用CAPITALqPCRProbeMix预混液和他品牌供应商(T)的预混液对人类基因组DNA进行稀释(从200ng至0.02ng)和扩增。
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这是从clontech拿到的载体。 看着和慢病毒差不多但是说明上写要用他公司的Lenti-X™ HT Packaging System来包装。 那这个意思是买完这个载体还要去买他的包装系统?这个也太麻烦了吧
第二个问题是不是构建的启动子区均要有一个TATA盒的结构在里面,不然构建的启动子如何就能驱动LUC的表达呢?
第三个问题是,如果我们在构建时长度延至ATG之后100-200BP的启动子是否会影响LUC的表达呢?
谢谢!
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。
我现在手上有PMD2.G与PSPAX2两个载体,求推荐与其配套的慢病毒过表达载体,谢谢。
RNA干扰主体实验的重点在于: 按照nature的标准,一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照:
⒈转染试剂对照(监控转染及培养条件对结果的影响);
⒉nonsense siRNA对照(监控外源核酸本身对结果的影响);
⒊positive siRNA对照(监控假阴性);
⒋技术重复对照(也叫off-target 对照,也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验,2个siRNA互为off-target control,当两者的表型相同时,才有可能是特异性的knockdown效应);
⒌rescue 对照(knockdown之后做超表达,看是否有性状的逆转,这也是为了说明knockdown的特异性);6.全表达组扫描对照(就是转录/表达芯片扫描,以最终确定表型不是由于off-target造成)。
实际实验中,全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中,1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照,基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照,主要是为了解决off-target效应,选做一种即可,一般建议选5,涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”, 一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。
mRNA水平:RT-PCR、Real-time PCR;蛋白质水平:Western-blot、ELISA、免疫组化;细胞表型水平:MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证(体内) 动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
体内法,即先做裸鼠成瘤模型,再将质粒或病毒导入裸鼠,检测RNA干扰效果。此法操作复杂,对质粒和病毒产品的质和量要求都较高,但是比较贴近实际,说服力较显著。体外法,即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞,再将肿瘤细胞导入动物体内,然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单,对质粒和病毒产品的质量要求较低,所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。向左转|向右转
①在荧光显微镜下,用波长约490 nm的紫外线激发后,即可观察到绿色荧光,直接、简捷、便于检测;
②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响,保证了极高的检出率;
③蛋白本身性质稳定;
④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性;
⑤其基因片段长度较小(约717 bp),易于构建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持荧光激发活性,为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。
pEGFP是一种优化的突变型GFP,使其产生的荧光较普通GFP强35倍,大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子,而且其N及C端均可融合,并不影响其发光。
pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因,如上图质粒图谱所示。
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点:
①从结构上看,该质粒具有很强的复制能力,可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞,这是保证目的基因稳定表达的因素之一;
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV,可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达;
③具有多克隆位点,便于目的基因的插入;
④该载体具有neo基因,可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。向左转|向右转
常用细菌质粒进行构建,构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端(多为黏性末端,也有平末端),采用DNA连接酶连接,导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
2、人体病灶细胞或者分泌型细胞有载体病毒受体;
3、DNA病毒,且酶切改造后具有复制能力;
4、表达产物对载体病毒没有抑制作用。
不知道是否准确,希望对你有帮助。
pCAMBIA2300特点:
大肠杆菌筛选抗性:卡那霉素。
植物筛选抗性:卡那霉素。
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