Description:
WithprimermixKAPALibraryAmplificationKits
ThegoldstandardforNGSlibraryamplification.
KAPALibraryAmplificationKitscontainKAPAHiFiDNAPolymerase,anovelenzymeengineeredforultra-highfidelityandrobustnessusingKapa’sdirectedevolutiontechnologyplatform.
KAPAHiFihasbecometheenzymeofchoiceforNGSlibraryamplificationduetoitsABIlitytoamplifycomplexDNApopulationswithhighfidelity,highefficiency,decreasedPCRduplicationratesandverylowbias.*ThisresultsinlowerduplicationratesandimprovedcoverageofGC-andATrichregions,promoters,lowcomplexityandotherchallengingregionsinallNGSlibraryconstructionworkflowsrequiringlibraryamplification.
Inadditiontothestandardlibraryamplificationformulation,KAPAHiFiisavailableinauniquereal-timeformulation,forapplicationsthatdemandprecisecontroloverlibraryamplification.Auracil-tolerantvariant,KAPAHiFiUracil+isalsoavailableforthehigh-efficiency,high-fidelity,low-biasamplificationoflibrariesconstructedfrombisulfite-treatedDNA.
KAPALibraryAmplificationKitsforIllumina® platformsnowalsoincludeanoptimallyformulatedLibraryAmplificationPrimerMix.
*Dataonfile.
ForResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.
ProductHighlights
Achievethelowestamplificationbiasandduplicationrates
- Loweramplificationbiasresultinimprovedrepresentationofalllibraryfragmentsandsequenceregions
- High-efficiencyamplificationleadstofeweramplificationcyclesandlowerPCRduplicates
- Lessadditionalnext-generationorSangersequencingneededtocompletegenomes
ImprovecoverageofGC-andAT-richregions
- LoweramplificationbiasimprovescoverageuniformityofGC-andAT-richregions,promoters,lowcomplexityandotherchallengingregions
- ImprovedoverallcoverageandcoverageuniformityobservedonbothIllumina andIonTorrent™ sequencingplatforms
Exerciseprecisecontroloverlibraryamplification
- KAPAReal-TimeAmplificationKitsallowforlibraryamplificationtobeobservedinrealtime
- Terminateamplificationattheoptimalpointforindividualsamples
- Optimizelibraryamplificationparametersforhigherthroughputworkflows
AmplifyNGSlibrarieswithindustry-leADIngfidelity
- KAPAHiFiwasengineeredusingdirectedevolutiontohaveenhancedproofreading(3′-5′exonuclease)activity
- Industry-leadingfidelityconfirmedby454sequencing
Applications:
Applications- AmplificationofIllumina libraries(DNAandRNAsequencing)
- Real-timeamplificationoflibrariespreparedfromlowinput,ChIPDNAandotherprecioussamples
- Pre-andpost-captureamplificationintargetedcaptureworkflows
KitSpecificationsandContents/Storage:
KitSpecificationsandContents/StorageKitscanbestoredforupto12months at-20˚C.
KitsincludeKAPAHiFiHotStartReadyMix(2X),aconvenientPCRmastermixcontainingKAPAHiFiHotStartDNAPolymerase,KAPAdNTPs,reactionbuffer,andMgCl2atafinalconcentrationof2.5mM.Kitswithprimersarealsoavailable.
Kitsforreal-timelibraryamplificationincludeareal-timeversionoftheKAPAHiFiHotStartReadyMix,aswellasfluorescentstandardstomonitorlibraryamplification.
Components
Specifications
- SpecDescription
- CompatIBLePlatformIlluminaHiSeq,MiSeq,NextSeq,andGAIIx
- LibraryTypeDNA,RNA,andbisulfite-treatedDNA
- StartingMaterialAnyNGSlibrarythatrequiresamplification
- SequencingApplicationsWholeGenomeSequencingWholeExomeSequencingTargetedSequencing(custompanels)RNA-SeqChIP-SeqAmpliconSequencing
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基因组酶切后,切胶回收浓度大概为多少才可以进行下一步实验?为什么二十几的浓度和载体连不上呢?载体也明明去磷酸化了,单连载体的时候也不会自连。那为什么把载体和酶切后的基因组连起来转化后挑菌做PCR验证却有很多空载呢?我的基因组酶切大小为2kb~4kb。上面那排7kb~10kb的带是什么东西呢?
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
高等生物一般具有10^5种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。
cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。
用,靠.规模析文库克隆.
1)同源探针:至少含所需cDNA克隆部确切序列.用于部克隆离cDNA文库全克隆.
2)部同源探针:探针序列与所要筛选cDNA克隆序列相关相同.用于克隆家族基.
3)总cDNA探针:
通反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通总或级离poly(A)+mRNA进行末端标记获cDNA探针.
cDNA扣除探针:
第种mRNA制备cDNA探 针, 连续与20倍量第二种mRNA杂交;
收未杂交cDNA探针, 再与100倍量第种mRNA杂交, 使原mRNA些特异序列高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库与调节水平所差别mRNA克隆.
5)合寡核苷酸探针
2 特异性免疫检测
cDNA表达文库,目基表达产 物能与特异性抗体发免疫反应,通酶加检测
3 cDNA克隆同胞检测
cDNA文库若干组含10-100克隆易于处理亚cDNA文库,每组亚cDNA文库进行检测,鉴定阳性库再断其更细库进行检测,直获阳性单克隆.
4 cDNA克隆确证
cDNA克隆含编码某特定蛋白质完整氨基酸序列放读框.
第四节 目基离
外源基:
插入载体内特定片段基.
目基:
些已或者准备要离,改造,扩增或表达特定基或DNA片段.图" class="ikqb_img_alink">
以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA
基因组文库
用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆。这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因。展开
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