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A-M system/Epoxy-Insulated Tungsten Microelectrode/
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A-M system
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血气分析是指通过测定血液中的氧分压 (PO2)、二氧化碳分压 (PCO2)、血液酸碱度(pH)及相关的一系列指标来评价患者的氧合作用、通气功能和酸碱状态,在呼吸衰竭的诊治、危重症的抢救和监护等发挥重要作用。目前大多数血气分析仪在血气分析的同时,还检测另一组非常重要的生命指标:钾、钠、钙等电解质浓度。电解质除维持体液渗透压及酸碱平衡外,还广泛参与 查看更多>
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我做 western 的时候,发现目前的资料都很老,网上的资料也大多互相传抄,说法各异,于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验,编辑了这份 western blot 操作步骤,内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节,并附上参考文献。我按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的 western 条带了,所以相信你也行。为了节省时间,我总结了一下 western bl 查看更多>
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酵母细胞的破碎实验123
liuyujia2007-04-05
欲破碎酵母细胞,提取胞内活性物质。尝试了超声波处理、热水处理、石英砂研磨、SDS、DMSO、甲苯处理、反复冻溶等方法,镜检观察效果都很不理想。请问还有什么方法较有效,或者是否有更可靠的检测方法?谢谢!
一种碎胶机破碎系统,包括底座、转刀、固定刀、筛孔刀,所述底座前后面设有平板,平板上设置有旋转轴,转刀固定在旋转轴上,所述底座的内端面左右两侧设有固定刀,固定刀的刃部面向旋转轴,所述筛孔刀安装在底座下部,筛孔刀位于旋转轴的正下方。通过设置转刀、固定刀和筛孔刀,三刀同时工作,胶块受到三重切割,可有效快捷的将大胶块破碎并且得到预定规格胶粒的颗粒更加均匀,降低了功耗,提高了工作效率,同时设置有液压缸控制筛孔刀的抽出和复位,打开门时便于对检修刀具及对内部进行清洁,不仅结构简单、操作维护也更加方便,且经济实用。
用5毫升规模的菌表达蛋白,收菌用缓冲液重悬后有250微升的重悬液,通常是加LoADIngBuffer混匀后煮样破碎细胞,但现在我还需要对细胞中的蛋白进行进一步处理,但如此少的重悬液又无法用超声波破碎,而煮样后所有蛋白都变性了,又无法继续处理,谁能告诉我还有什么效果好的破碎这样的重悬液的方法?
大家好,有谁知道真菌细胞壁的破碎方法,各种试剂的使用浓度,越详细越好,谢谢
首先说明,因为最近有人向我要,我以前也发过,好像是试剂配方不全,所以在此补发一个,望版主不要删了!多谢!

快速细胞破碎法鉴定转化子DNA(分离效果一般,二者要相差比较大才行,我常用前者,一般T载体上的要五百bp以上,一千bp以上最好!)
快速细胞破碎法鉴定转化子DNA

1、转化子菌落接种于相应的抗性培养基2.0ml,过夜培养。(要求设立对照!)
2、制备0.8%琼脂糖胶。
3、取1.5ml过夜培养物离心,15kr/min,1min;弃上清。(剩余保种!)
4、加水重悬,离心如上。留沉淀。
5、每管加50—100µl破碎细胞缓冲液(见后配方),充分涡旋,使菌体悬浮均匀
6、水浴37℃,15min。
7、离心15kr/min,15min。
8、立即取20-30µl上清点样进行电泳,4—6V/cm。
9、电泳,当溴酚蓝到达凝胶板的2/3时,停止电泳。
10、染胶15—30min。
配方:50mMTris-HCl(pH6.8);1%SDS;2mMEDTA;400mM蔗糖;0.01%溴酚兰
配法:1MTris-HCl(pH6.8),10ml;20%SDS,10ml;250mMEDTA,1.6ml;蔗糖27.2g;1.2%溴酚兰1.67ml加水至200ml;

煮沸法快速分析转化子DNA

1、挑单菌落于2.0ml相应抗生素液体培养基中,37℃振荡过夜(约16小时)。
2、取1.5ml过夜培养物于离心管中,15kr/min,1min。(剩余保种!)
3、弃上清,倒扣、流尽。
4、加入350µl由下列试剂组成溶液,混匀。
(8%蔗糖、0.5%TritonX-100、50mMEDTA(pH8.0)、10mMTris-HCl(pH8.0))
5、加入25µl新鲜配制的10mg/ml的溶菌酶(溶于10mMTris-HClpH8.0中),涡旋3--5sec。
6、立即将离心管浸入沸水浴40sec。
7、离心15kr/min,10min。
8、转移上清至另一离心管,加入2.5MNaAc40µl,加入异丙醇420µl,混匀后冰浴15min,沉淀DNA。
9、离心15kr/min,15min,将上层异丙醇弃去,真空抽干。
10、加入50µlTE缓冲液重悬,(含Rnase50µg/ml)。37℃保温10min。
11、取10µl样品点样,电泳,染胶。观察质粒DNA的区带位置。(要求有对照电泳!)
对细胞破碎后获得的生物大分子的电泳方法大都采用凝胶电泳。如果要分析核酸等大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳;如果是分析蛋白质,则通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行。以DNA凝胶电泳为例,电泳的操作步骤如下:

1、安装电泳槽
将有机玻璃的电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。
3、灌胶
将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。
5、加样
将DNA样品(DNA样品是细胞破碎之后用离心管离心沉淀获得的)与加样缓冲液按4:1混匀后,用微量移液器将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μl,记录样品的点样次序和加样量。
6、电泳
安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳1-3hr,当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。
7、染色和观察
取出凝胶,放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂,操作时要小心,必须戴手套。
我用pET28a作载体,转化E.coliBL21。诱导400mL菌液收菌后PBS洗3遍,后用PBS定容至10mL,加溶菌酶至终浓度1mg/ml。作用30min,后加PMSF,PeP,BEN.混匀,超声,超3s停4s,超了1h菌液没大变化。以上操作均在冰上。

我怀疑溶菌酶有问题,因为其消化的30min内菌液几乎没大变化,而我曾看到别人用溶菌酶消化时菌液变的挺粘稠。

今下午再做时还是没什么变化,但发现溶菌酶在冰上静置2-3h后竟然沉淀下来了,而且上清和下面的白色溶菌酶分界明显,是我的溶菌酶配的有问题吗?出现这种情况溶菌酶还能用吗?我是-20度保存的。

下一步怎么处理菌液呢?

请高手多多指教!
RKEF工艺技术123
2017-09-30
什么是RKEF工艺
货物学试题(2)123
找不回的岁月2017-09-30
烘干机
会不会导致DNA片段破碎?
超声波细胞破碎123
ecor2004-10-19
我最近做超声波破碎大肠杆菌,但是一直效果都不好,看了一些帖子,但是还是没弄明白。请问:裂解缓冲液需要加多少(?ml/g菌)?超声波作用的时间一般是多少(有人说半小时,有人说10分钟以内)?破碎后菌液是什么状态的?会变澄清吗?如果一次做60ml菌液(置于100ml离心管中),需要注意什么呢?
加loADIngbuffer裂解细胞/细菌以后,样品里面的DNA会和SDS形成一团东西,无法直接上样

平常都是用超声破清洗器水浴超声破碎大约20分钟,然后上样的

但是一方面,常温超声不知道会不会造成蛋白降解破坏,因为发现加冰以后超声会变得非常弱,所以都么加冰。另一方面,因为水浴超声声强是不均匀的,如果样品多的话,会发现有些已经超碎DNA,但有些还是一团。

不知道是否有其他更好的方法?
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