TheEpiCorneal3Dhumantissuemodelprovidesahighlypredictivenon-animalalternativetoassessdrugdelivery,infection,woundhealing/tissueregenerationanddiseasemodeling(i.e.DryEye).
Technology:
MatTek’sEpiCornealtissuemodelconsistsofnormalhumancornealepithelialcellsculturedtoformastratified,squamousepitheliumwhichcloselyparallelsnormalhumancornealtissue.Thecornealcells,culturedonspeciallypreparedcellcultureinsertswithserum-freemedium,differentiatetoformamulti-layeredstructure.
Usedindrugdeliveryanddrugdevelopment,EpiCornealisamitoticallyandmetabolicallyactivetissuewithbarrierpropertiesapproachingthoseofthehumancornea.EpiCornealcanbestimulatedtoreleasemanycytokinesknowntobeimportantininflammationanddiseasessuchasdryeye.Further,theadvanced3Dtissuemodelexpressescorneaspecificdrugtransportersandmetabolizingenzymes.
Applications:
CornealDrugDeliveryandCornealToxicity
EpiCornealcloselyrecapitulatesthephysiology,3Dtissuearchitecture,andfunctionofthehumancorneaforuseinpharmaceuticaldevelopmentapplications.
ContactDr.YuliaKaluzhnyformoreinformation.
BrowseourreferencelibrarytoseehowourEpiCornealtissuehasbeenusedintheseareasofstudy.
TechSpecs:
Tissue
Kit:AstandardEpiCornealkit(COR-100)consistsof24tissues.(Tissue“kits”containtissues,asmallamountofculturemedium,andplasticware;contactMatTekforspecifickitcontents)
Formats:9mmindividualinserts–tissueculturesubstrateischemicallymodifiedwithaporesizeof0.4μm
Culture:Air-liquidinterface
Histology:4-5celllayers–stratified,squamousmorphologyandtissuestructure
Lotnumbers:Tissuelotsproducedeachweekareassignedaspecificlotnumber.Aletterofthealphabetisappendedtotheendofthelotnumbertodifferentiatebetweenindividualkitswithinagivenlotoftissues.Alltissuekitswithinalotareidenticalinregardstocells,medium,handling,cultureconditions,etc.
Shipment:At4°Conmedium-supplemented,agarosegels
Shipmentday:EveryMonday
Delivery:TuesdaymorningviaFedExpriorityservice(US).OutsideUS:Tuesday-Thursdaydependingonlocation
Shelflife:Includingtimeintransit,tissuesmaybestoredat4°Cforupto3dayspriortouse.However,extendedstorageperiodsarenotrecommendedunlessnecessary.Inaddition,thebestreproducibilitywillbeobtainediftissuesareusedconsistentlyonthesameday,e.g.Tuesdayafternoonorfollowingovernightstorageat4°C(Wednesdaymorning)
Cells
Type:Normalhumancornealepithelialcells(HCEC)
Geneticmake-up:Singledonor
Derivedfrom:Healthydonor
Screenedfor:HIV,Hepatitis-B,Hepatitis-C,mycoplasma
Medium
Basemedium:Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM).
Growthfactors/hormones:Epidermalgrowthfactor,insulin,hydrocortisoneandotherproprietarystimulatorsofcornealepithelialdifferentiation.
Serum:None.
Antibiotics:Penicillin(50U/ml)/Streptomycin(50µg/ml)
Anti-fungalagent:AmphotericinB(0.125µg/ml).
pHIndicator:Phenolred.
Alternatives:Phenolred-free,antibiotic/anti-fungal-free,orhydrocortisone-freemediumandtissueareavailable.Agentsareremovedatleast3dayspriortoshipment.
Maintenancemedium:MostexperimentswithEpiCorneal™areperformedwithin48hours.However,forlongerexperiments,thetissuecanbemaintainedinCOR-100-MM(identicaltoEpiCorneal™assaymedium).
QualityControlandSterility
Visualinspection:Alltissuesarevisuallyinspectedandifphysicalimperfectionsarenoted,tissuesarerejectedforshipment
Sterility:Allmediausedthroughouttheproductionprocessischeckedforsterility.Maintenancemediumisincubatedwithandwithoutantibioticsfor1weekandcheckedforsterility.Theagarosegelfromthe24-wellplateusedforshippingisalsoincubatedfor1weekandcheckedforanysignofcontamination
Screeningforpathogens:AllcellsarescreenedandarenegativeforHIV,hepatitisBandhepatitisCusingPCR.However,noknowntestmethodcanoffercompleteassurancethatthecellsarepathogenfree.Thus,theseproductsandallhumanderivedproductsshouldbehandledatBSL-2levels(biosafetylevel2)orhigherasrecommendedintheCDC-NIHmanual,“BiosafetyinmicroBIOLOGicalandbiomedicallaboratories,”1998.Forfurtherassistance,pleasecontactyoursiteSafetyOfficerorMatTektechnicalservice
Notificationoflotfailure:IfatissuelotfailsourQCorsterilitytesting,thecustomerwillbenotifiedandthetissueswillbereplacedwithoutchargewhenappropriate.BecauseourQCandsterilitytestingisdonepost-shipment,notificationwillbemadeassoonaspossIBLe(Undernormalcircumstances,ET-50failureswillbenotifiedbyWednesday5p.m.;sterilityfailureswillbenotifiedwithin8daysofshipment)
ebiomall.com
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本研究从新合成的十种核苷类似物中筛选具有抗肿瘤活性的化合物, 观察其抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用,并探讨可能的作用机制。
刚入实验坑的新人一枚，有关凋亡和增殖的检测方法看来看去有好多啊，我想问下大神们目前用的最多的有关细胞凋亡和增殖的检测方法分别是什么？哪些相对更加精确一些，而哪些只是粗略的看一下啊？？
郎格罕斯细胞组织细胞增生症(Langerhanscellhistiocytosis)或郎格罕斯细胞病(Langerhans#39;celldisease)又称组织细胞增生症X(HistiocytosisX),为一组少见的,以郎格罕斯细胞增生为主的疾病.本病的病因和发病机制尚不清楚,有人认为是反应性疾病,而非真性肿瘤.也有人认为本病是免疫系统异常所致,但通过PCNA免疫组化可见较多的阳性细胞,且病变中常见核分裂象故认为是增生性疾病,可能为肿瘤性增生。这种病要看医生。
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
①持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。机体内某些组织需要不断的更新,组成这些组织的细胞就必须通过不断分裂产生新细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。如性细胞(包括卵母细胞和精原细胞),它们要不断地产生配子; 造血干细胞需要不断地产生红细胞和白细胞;上皮基底层细胞需要通过分裂不断补充表面老化死亡的细胞; 植物的根茎尖端细胞需要通过分裂进行生长等都是具有正常周期的持续分裂细胞。
②终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞，它们不可逆地脱离了细胞周期, 但保持了生理活性机能。这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物的红细胞、神经细胞、多形性白细胞、肌细胞等, 这些细胞一旦分化,就永远保持这种不分裂状态直到死亡。
③G0细胞,又称休眠细胞，暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂, 也称静止细胞群。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。淋巴细胞可通过与抗原的相互作用诱导增殖。在胚胎发育早期(卵裂期)，所有的细胞均为周期性细胞, 以后随着发育成熟, 某些细胞进入了GO期, 某些细胞分化后丧失分裂能力。到成体时,只有少数细胞处于增殖状态, 它们的增殖仅作为补充丢失的细胞, 或对外界刺激的反应。
1，CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
2，CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
3，在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
4，每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
5，如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。
6，哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
7，在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
8，设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
9，说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
10，在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
11，必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
区别：
1.CCK-8为一瓶溶液，毋需预制，即开即用，MTT法的步骤比较多也比较繁琐。
2.如果药物本身有颜色，那么采用MTT法可以通过离心去除颜色的干扰，多次的离心和吸取上清要求操作者要小心和仔细，否则会降低试验的准确率。
3.CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT。其对悬浮细胞的测定有其独到之处。
4.对细胞毒性小，CCK-8对细胞生长没有影响，测完细胞活性后，去掉含CCK-8的培养基，用新鲜培养基可以继续培养，并且还可以继续做其它指标的检测，而MTT就不能。
5.CCK-8反应时间也短，适合做急性作用。
6.CCK-8线性范围更宽，灵敏度更高。
7.发文章过程中，MTT因其重复性差，一般得不到认可。
应用：
被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。
相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。
3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次
4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。
5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。
6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片：
图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。
