Astrocytes are the major cell type and among the most functionally diverse group of cells in the mammalian brain. They provide a variety of supportive functions to their partner neurons in the central nervous system (CNS); such as neuronal guidance during development, and nutritional and metabolic support throughout life. Human Astrocytes play important roles in various pathological processes. Impairment of normal astrocyte functions during stroke and other insults can critically influence neuron survival. Long-term recovery after brain injury, through neurite outgrowth, synaptic plasticity, or neuron regeneration, is also related to astrocyte surface molecule expression and trophic factor release. Much of what we have learned about astrocytes is from in vitro studies and astrocyte culture is a useful tool for exploring the diverse properties of this cell type. They are also very useful cells to stablish disease models for High Throughput and Hight Content Screening.
- Product Description
- Specifications
- Characterization
- Similars
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- Technical Resources & Protocols
- Reference: P10251-IM
- Size/Quantity: 1x106 cells / vial
- Product Use: For research use only
- Shipping Conditions: Dry Ice
Human Astrocytes760,00€ – 2.480,00€
- Technical Sheet / Cell Culture Manual
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一、细胞冷冻保存
1.材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normalhumanfibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④othersUSPensions:5～10×106cells/ml，humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。
（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。
3、步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
各位大神们，我的课题实验需要提取临床患者抗凝外周血的血浆进行冻存和后续研究，由于血样珍贵，老板让我把离心提取血浆之后所剩的沉淀也加以利用，从剩下的沉淀（血细胞）当中提取出白细胞并冻存，用于之后做western。我用自己的外周血标本试做了一下，5mlEDTA抗凝外周血，3000rpm4℃离心10min后，取上层血浆分装-80冻存用于相关ELAISA实验，然后在下层沉淀（血细胞）中加入3倍体积的溶血剂，静置10min使红细胞裂解之后离心，结果并没有明显的分层，我重复了加溶血剂裂解红细胞并离心的步骤，到最后的结果还是只能达到如图所示。可以看到一层灰白色物质，但无法完全分离提取白细胞，所以想请教各位大神：①我的操作中有哪些错误烦请大家指出；②我用的溶血剂是OptilyseC的溶血剂，是否是试剂的问题？是否需要购买专门的红细胞裂解液，或者自行配制？③为什么裂解红细胞之后分层并不明显，多次离心之后还是分不清楚？④如果可以提取出白细胞，是否可以直接加入冻存液将白细胞-80℃冻存用于之后的研究（主要是Western，不影响细胞内蛋白即可）？因为是第一次做实验，血样珍贵，这种处理方法做过的人也很少，烦请有经验的各位批评指正，向大家虚心请教学习，不胜感激！
做ELISA实验，在处理样本前应该先了解收集样本的注意事项。
【标本收集注意事项】
1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.血清和血浆避免使用溶血，高血脂标本。
3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃电冰箱内，避免反复冻融。
5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。
6.收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程。
7.收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），认为所有标本都具有一定的潜在危险性。
8.样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。
样本正确的处理方法应该是这样的：
【标本处理办法】
1.血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
2.血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离
心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）
保存。
3.组织匀浆：切取组织块，0.01MPBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
4.细胞培养上清：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存。
5.尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃3-6个月）保存。
注：样品稀释的一般原则
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。
希望可以给您提供帮助，祝您科研顺利！
一、试验原理
细胞培育可分为原代培育和传代培育。直接从体内获取的安排细胞进行初次培育为原代培育；当原代培育的细胞增殖到达必定密度后，则需求做再培育，即将培育的细胞涣散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培育，为传代培育，传代培育的累积次数即是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，试验证实这么能够最大极限的保留细胞生机。现在细胞冻存多选用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能进步细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，削减细胞内冰晶的构成，然后削减因为冰晶构成形成的细胞损害。复苏细胞应选用敏捷消融的方法，这么能够确保细胞外结晶在很短的时间内即消融，防止因为缓慢消融使水分渗入细胞内构成胞内再结晶对细胞形成损害。
二、试验办法
资料：
小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培育皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培育瓶，培育液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培育箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
办法：
（1）原代培育：
1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起肌肤，用解剖剪剪开肌肤一个横切断，将肌肤向上扯开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左边找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培育皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洁屡次，并除掉剩余无用的安排。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，悄悄在筛网上进行碾磨，一起不断滴加不含血清的培育液冲刷。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去掉血液等）。
6.参加10ml培育液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培育瓶中，悄悄摇晃混匀，在培育瓶上。
面做好象征，注明细胞、组别及日期。然后将培育瓶置于二氧化碳培育箱中培育。
（2）传代培育：
1.倒置显微镜下调查细胞形状，确定细胞是不是需求传代。
2.培育液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。
3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培育液瓶中。
4.打开培育瓶，瓶口过火，将培育瓶内的培育液悄悄倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培育基。
5.培育瓶参加0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下调查到细胞收回突起变圆时当即翻转培育瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，参加少数的含血清的新鲜培育基。
6.取弯头滴管重复吹打细胞使其脱壁并涣散，再依据分传瓶数补加必定量的含血清的新鲜培育基，制成细胞悬液，然后分装到新培育瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍反转，以利于CO2气体的进入，将培育瓶放回CO2培育箱。
7.对半贴壁培育细胞，不需胰酶，直接吹打，参加新鲜培育基，然后分装到各瓶中。
（3）冻存：
1.汲取传代后的细胞悬液，离心，去掉培育液，参加冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目通常为（5～10）×106个/ml，2ml冻存管中通常放1～1.5ml细胞）。
2.按步冻存
o冷冻保留办法一：规范的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可敏捷浸入液氮中。
o冷冻保留办法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长时间保留。
（4）复苏：
1.取出冷冻管，当即放入37℃水浴箱中敏捷冻结，轻摇冷冻管使其在1分钟内悉数消融，移入无菌操作台内。
2.打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
4.加恰当培育液后将细胞转移至培育瓶中，37℃培育，第二天调查成长状况。
三、试验成果核算
1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108个脾细胞。
2.细胞接种后通常几小时内就能贴壁，并开端成长，如接种的细胞密度适合，5天到一星期即可构成单层。
3.通常状况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培育瓶壁上，2～4天就可在瓶内构成单层，需求再次进行传代。
四、留意事项
1.选材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，留意不要损害脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。
2.冲刷脾脏时要尽量洗净血污，去掉无用安排，并要防止安排枯燥。
3.碾磨后及时用清水冲刷筛网，防止安排、细胞堵塞网孔。
4.计数前，留意吸尽平皿里的细胞，充沛混匀，使细胞分散成单个细胞。
5.试验操作应在操作台中心无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。
6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才干挟取安排，防止构成安排损害。
7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，防止烧焦发生有毒气体，损害培育细胞。
8.汲取过营养液后的吸管不能再用火焰炙烤，因残留在吸管头中营养液能烧焦构成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。
9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等一切可能与细胞触摸的有些，如已触摸，要用火焰炙烤消毒或取备品更换。
10.敞开、封闭长有细胞的培育瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。
11.换液时倾倒废液，瓶口不能触摸废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。
12.吹打细胞时，要留意边角的细胞是不是吹打下来。
13.手或相对较脏的物品不能通过敞开的瓶口上，即不可以在敞开容器上方操作。
14.每次操作只处理一株细胞，防止构成细胞穿插污染。
15.留意本身的安全，关于来自人源性或病毒感染的细胞株应格外当心。操作过程中，应防止引起气溶胶的发生，当心有毒性试剂例如DMSO，并防止尖利物品伤人等。
16.从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但最佳为对数成长期细胞。在冻存前一天最佳换一次培育液。
17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，防止冻伤。
18.冻存和复苏最佳用新配制的培育液。
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 （一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
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