第1阶段：RNA和DNA的分离

一次双向消减，需要总量为2ug的基因组DNA或CDNA。大多数分离RNA和基因组DNA的方法都适用于本实验（Sambrooketal.1989；ChomczynskiandSacchi1987；Farrell1993)。如果可能，尽可能使用同样的试剂和方案纯化待比较的样品。如果是基因组DNA作为初始材料，下一步为RsaⅠ消化（本方案的第3阶段）；如果是RNA作为初始材料，下一步则为cDNA的合成（本方案的第2阶段）。

第2阶段：cDNA的合成

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（10mmol/L)

DTT,0.1mol/L

EDTA,0.2mol/L

第一链缓冲液，5X

矿物油
SSH技术需要很精确的PCR。根据作者的经验，矿物油是维持精确性所必需的.只有在缺乏矿物油而且样品更容易分析时，才使用热盖做大规模的PCR筛选.因此笔者强烈建议，在方案5之前不要使用热盖。

第二链缓冲液，5X

TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LNaCl)

2.酶和酶缓冲液

AMV逆转录酶（20U/ul)

3.核酸和寡核苷酸

cDNA合成引物（10umol/L)

poly(A)⁺RNA

4.放射性化合物

可选：[a^-32P]dCTP(10mCi/ml，3000Ci/mmol)(lCi=3.7X1010Bq)

5.专用设备

热循环仪，或者预设为16°C、42°C和72°C的水浴

6.附加试剂

酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂

二、方法

1.第一链cDNA的合成

（1）在0.5ml离心管中，将每个检測和驱动样品与下面的成分混合。

poly(A)+RNA(2ug）                    2~4ul

cDNA合成引物（10umol/L)          1ul

H₂0                                              加至5ul

（2）用一滴矿物油覆盖样品表面，在72°C热循环仪或水浴中温育2min。

（3）在室温下冷却2min。

（4）在每个反应管中加入下列成分。

第一链缓冲液，5X                 2ul

dNTP溶液（各10mmol/L)      1ul

H₂O*                                     0.5ul

DTT,0.1mol/L                          0.5ul

AMV逆转录酶（20U/u1)          1ul

*可选：要想检测cDNA合成的进程，将0.5ul[a^-32P]dCTP(10mCi/ml,3000Ci/mmol)加入到9ulH₂0中，再取0.5ul稀释的标记物代替上面的H₂0

（5）轻柔地涡旋混匀，并短暂离心。

（6）在热循环仪或水浴中，将离心管42°C温育90min。

（7）将离心管置于冰上，中止第一链cDNA的合成，并立即进入第二链cDNA的合成。

2.第二链cDNA的合成

（8）将下列成分（在冰上预冷）加到第一链合成管中。

灭菌H₂O                       48.4ul

第二链缓冲液，5X            16.0ul

dNTP溶液（10mmol/L)     1.6ul

第二链合成酶混合物，20X  4.0ul

（9）混匀并短暂离心，最终体积应该为80ul。

（10）将离心管在16°C(水浴或热循环仪）温育2h。

（11）加入2ul(6U)T4DNA聚合酶，充分混匀。

（12）在水浴或热循环仪中，将离心管16°C再温育30min。

（13）加入4ul0.2mol/LEDTA,中止第二链的合成。

（14）进行酚：氯仿抽提和乙醇沉淀。

（15）用50ulTN缓冲液重新溶解沉淀。

（16）从上面溶液中取6ul，加到一个新的离心管中，-20°C保存到RsaI消化之后。

这个样品将进行琼脂糖凝胶电泳，以估计dscDNA合成产物的产量及大小范围。

第3阶段：RsaⅠ消化

进行以下操作程序，处理每个实验所用的双链驱动和检测DNA样品。这一步产生最适于消减杂交的短的、平末端dsDNA片段。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

EDTA,0.2mol/L

TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl、pH7.6,10mmol/LNaCl)

2.酶和酶缓冲液

RsaⅠ(10U/ul)

限制缓冲液，10X

3.核酸和寡核苷酸

由第1阶段获得的基因组DNA,或者由第2阶段获得的cDNA,每个双向消减反应需2ug

4.专用设备

水浴，预设为37°C

5.附加试剂

酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.将下列试剂加入上面第2阶段[原文为方案2(Protocol2)——编者改]第8步的离心管或基因组DNA(gDNA)样品中。

dscDNA或基因组DNA              43.5ul

尺似1限制缓冲液，10X           5.0ul

RsaⅠ(10U/ul)                              1.5ul

2.混匀，在37°C下温育2~4h。

3.检测RsaⅠ消化的效率，通过2%的琼脂糖凝胶电泳分析5ul消化产物，用未消化的DNA[第1阶段（原文为方案1--编者改）的基因组DNA]作对照。在电泳过程中继续消化，直到对分析结果满意时再中止反应。

4.加入2.5ul0.2mol/LEDTA,中止消化反应。用酚：氯仿抽提，并用乙醇沉淀法收集DNA。
本步骤不推荐使用糖原或任何类型的共沉淀剂。这些试剂可能提高DNA溶液的黏度，并抑制后面的DNA杂交。同时也应避免使用基于硅介质的PCR纯化系统。

5.每个沉淀用6ulTN缓冲液（不用H₂0)溶解，-20°C保存。驱动DNA的制备至此就完成了。

第4阶段：接头连接

强烈推荐每一对检测/驱动DNA都在两个方向进行消减。设计正向消减是为了富集检测者中存在而驱动者中不存在的差异分子，设计反向消减是为了富集驱动者中存在而检测者中不存在的差异分子。利用正向和反向消减DNA，对于最终的消减检测者DNA文库的差异筛选（方案6)是很有用的。检测DNA分别与ADI(检测者1-1与2-1)和Ad2R(检测者1-2与2-2)连接。还应该做一个两个接头（Adi与Ad2R)同检测DNA(未消减的检测者对照1-c和2-c)的连接，作为消减反应的负对照。接头不连接驱动DNA。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

ATP,3mmol/L

EDTA,0.2mol/L

矿物油

TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl、pH7.6,10mmol/LNaCl)

2.酶和酶缓冲液

连接酶缓冲液，10X

T4DNA连接酶（400U/ul)

3.核酸和寡核苷酸

接头Ad1(10umol/L)

接头Ad2R(10umol/L)

RsaⅠ消化的检测DNA

4.专用设备

水浴，预设37°C

5.附加试剂

酚：氯仿抽提和乙酵沉淀所需的试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.从上面RsaⅠ消化过的检测DNA中取出1ul，用5ulTN缓冲液稀释。

2.按照下列成分，为每个反应配制主体连接混合液。

H₂O                    2ul

连接缓冲液，5X           2ul

ATP(3mmol/L)                    1ul

T4DNA连接酶（400U/ul)    1ul

3.对每一个检测DNA混合液，按照所示的顺序，与以下试剂一起加到0.5ml离心管中。吸打溶液，使之彻底混合。



4.在一个新离心管中，将2^1的检测者1-1与24的检测者1-2混合。这是作为非消减的检测者对照1-c。对于每个检测DNA样品，都同样做一个对照。连接之后，在每一个未消减的检测者对照管中，大约有1/3的DNA分子会被接上两个不同的接头，从而适于使用带有接头的引物进行指数式的PCR扩增。

5.用一滴矿物油覆盖样品，短暂离心后在16°C温育过夜。

6.加入1ul0.2mol/LEDTA,中止连接反应。

7.72°C处理样品5min,使连接酶失活。

8.从每个未消减检测者对照（1-c，2-c…）中取出1ul，用1mlTN缓冲液稀释。这样品将用来做PCR扩增（方案3)。
实验中连接接头的检测DNA1-1和1-2至此就制备好了。

9.进入下一部分操作前，先进行连接效率的检测。

第5阶段：连接效率检测

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（包含所有4种dNTP，每种为10mmol/L)

矿物油

2.酶和酶缓冲液

PCR缓冲液，10X(40mmol/LTricine-KOH，22°C下pH9.2;3.5mmol/L乙酸镁;10mmol/L乙酸钾；75mg/mlBSA，或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

3.核酸和寡核苷酸

PCR引物P1

未消减对照样品（方案1第4阶段第4步）

4.专用设备

热循环仪

5.附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.从每个未消减对照样品中各取1ul,分装到0.5mlPCR管中。

2.将以下试剂混合，为所有反应配制主体琨合液。

H₂O                                            19.5ul

PCR缓冲液，10X                   2.5ul

dNTP溶液（每管10mmol/L)      0.5ul

PCR引物P1                          1.0ul

聚合酶混合液，50X               0.5ul

总体积                               24.0ul

3.混匀并短暂离心。

4.第1步准备的每个反应管中，各分装24ul主体混合液

5.用1滴矿物油覆盖样品。

6.将反应混合液放在热循环仪中，72°C温育5min,以延伸接头。

7.立即进行以下热循环。



8.每管取4ul,在2%琼脂糖凝胶上进行分析。

重点：这个PCR产物应该具有RsaⅠ消化DNA类似的模式。如果15个循环后，没有可见的PCR产物，要另加3个循环，再分析PCR产物。如果21个循环后还没有可见的PCR产物，则需要检査聚合酶混合液的活性。如果聚合酶混合液或其他PCR试剂的活性没有问题，应该用新鲜的样品重复连接反应，再进入下一步。