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实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | 寡核苷酸引物测序酶终止混合液测序酶缓冲液焦磷酸酶混合液 仪器、耗材 | 离心机离心管微量滴定板 实验步骤 | 1. 对于每个单链模板:将下列试剂混合于0.5ml微量离心管中 (1)0.5pmol单链DNA模板 (2)0.5pmol引物 (3)1μl10×测序酶缓冲液 (4)加水至10μl (5)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡)。于65℃温育6min,然后于37℃温育20min,转到步骤3。 2. 对于每个双链DNA模板:以下列混合液重溶含0.5pmol变性双链模板的干燥沉淀物。 (1)1pmol引物 (2)1μl10×测序酶缓冲液 (3)加水至10μl (4)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡),于37℃温育30min,然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。 3. 当引物正和模板退火时,对应每个待测模板,分别标记好A、C、G、T4个微量离心管。 DNA测序用酶的特性 3. 分别加入2.5μlA、C、G、T测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部 4. 在临用前,才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~2U测序酶/μl,置于冰浴。 5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中 (1)2μl 标记混合物 (2)0.5~1.5μl 10mCi/ml[α-32P]dATP (3)2μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液 (4)总体积在14.5~16μl,于25℃(室温)温育5min。 6. 加入3.5μl标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。 7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀,对 A、C、G、T 管重复此过程,每次均需更换吸头,于37℃温育5~10min。 8. 加入4μl终止/加样染料液,于95℃水浴2min,然后置于冰浴。 9. 每样品各取2~3μl加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。 |
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发布于 : 2021-09-20
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