【求助】逆转录酶的Buffer问题
2013-10-28
问题描述:
各位高手!
最近遇到了实验上的大问题,就是用一步法做RNA的荧光定量PCR时,发现低浓度的做不出来,而DNA是可以的,想请问各位在一步法PCR中有没有什么高见,就是逆转录的Buffer有没有什么需要注意的地方!就是在逆转录酶的最适Buffer和Taq酶的最适Buffer中寻找一个最适的Buffer!
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瞿同学
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我用的TAKARA的实时荧光定量PCR试剂盒,东西都是配好的,不需要调整buffer的量,用起来效果挺好的,可以建议你用这个哦,零售价大概1100-1500左右
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wujp26
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瞿同学我用的TAKARA的实时荧光定量PCR试剂盒,东西都是配好的,不需要调整buffer的量,用起来效果挺好的,可以建议你用这个哦,零售价大概1100-1500左右你用的CT值能做到多少?能到CT34以后吗?
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瞿同学
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没看懂你的意思,CT值是循环数,其实反映的是你的基因的表达量,改变Ct值,可以调整原始的CDNa浓度啊,一般测到的Ct值大概是28-30,这个是根据你的基因不同来定的呀
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chao_yw
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果断用商业化的试剂,楼上提到的TAKARA是一个可以的选择。另外Ct值一般大于33后都是不太能接受的,像你说的34一般审稿人都会提出质疑的(主要针对SYBRGreen)。
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wujp26
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瞿同学没看懂你的意思,CT值是循环数,其实反映的是你的基因的表达量,改变Ct值,可以调整原始的CDNa浓度啊,一般测到的Ct值大概是28-30,这个是根据你的基因不同来定的呀我的意思是用CT24左右的CDNA去稀释,按10倍梯度稀释,但是后面的就没有了,其实样本的有的,但是它就是不能逆转录出来,所以就没有扩增的曲线,然后就没有CT值。
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wujp26
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chao_yw果断用商业化的试剂,楼上提到的TAKARA是一个可以的选择。另外Ct值一般大于33后都是不太能接受的,像你说的34一般审稿人都会提出质疑的(主要针对SYBRGreen)。有没有人自己配Buffer啊?
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chao_yw
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有当然有,但是一般不会比商业产品的好。这时候不应该心疼钱。另外救市何必要用一步法呢?转成CDNA后有利于样品保存,并且想做定量PCR时就可以做,都不用重新提RNA。
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cyqcan
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各位高手!最近遇到了实验上的大问题,就是用一步法做RNA的荧光定量PCR时,发现低浓度的做不出来,而DNA是可以的,想请问各位在一步法PCR中有没有什么高见,就是逆转录的Buffer有没有什么需要注意的地方!就是在逆转录酶的最适Buffer和Taq酶的最适Buffer中寻找一个最适的Buffer!请问一下,你现在找到那个合适的buffer了吗?
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