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| 试剂、试剂盒 | 十六烷基溴化吡啶EDTA-TrisEDTA-Tris-DNA溶液乙醇-乙酸钠溶液乙醇乙酸钠TE(pH7.6)或适当的预杂交液核酸和寡核苷酸纯化的原料 仪器、耗材 | 干冰乙醇浴 实验步骤 | 材料 溶液和缓冲液 稀释贮存液至适当浓度。 十六烷基溴化吡啶（CPB)1%,m/V) 将1gCPBW(sigma公司）溶于100ml水中，加热并用磁力搅拌器搅拌溶液可加速溶解。待去污剂全部溶解后，将溶液冷却至室溫，用硝酸纤维素滤膜过滤（0.45um孔径） EDTA-Tris(0.5mol/L,pH6.0) 用60ml水溶解0.1molEDTA,在搅拌溶液的同时,加入Tris碱（粉末)，直到溶液pH值达到6.0,此时Tris的浓度为约1.2mol/L。加水使溶液的体积为200mL。这不同于常规配制方法，但对于阳离子去污剂有效地沉淀核酸是非常必要的（Sibatani1970)。 EDTA-Tris-DNA溶液 用50mmol/LEDTA-Tris(pH6.0)(1:10稀释0.5mol/LEDTA-Tris溶液）溶解载体DNA(鮭精DNA),使其浓度为50ug/ml载体DNA应大小均一、不干扰放射性标记核酸与靶DNA的杂交。用超声处理或鲑精DNA片段可满足多数实验的要求（超声处理鲑精DNA的长度在600~5000bp，可以从Pharmacia公司购得或按第6章的方案10制备)。 乙醇-乙酸钠溶液 80%(V/V)乙醇 20%(V/V)乙酸钠（0.1mol/L,pH5.2) TE(pH7.6)或适当的预杂交液 见步骤8。 核酸和寡核苷酸 放射性标记的寡核苷酸 纯化的原料是方案2(步骤3或步骤5)的反应混合液，T4噬菌体多核苷酸激酶已在68°C灭活。 专用设备 干冰/乙醇浴 方法 1.含有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入5~10倍体积的EDTA-Tris-DNA溶液，充分混合。 为进行有效的沉淀，务必使终末反应混合液中EDTA-Tris-DNA溶液的离子成分占优势，混合液的终体积与放射性标记寡核苷酸的浓度对本方法的效率不产生影响。 2.加入足量的1%CPB,使离心管中混合液的去污剂浓度达到0.1%,充分混匀。 3.将离心管置于干冰/乙醇浴中至混合液冻结。从冰浴中取出离心管，室温下使混合液融化。 4.4°C下以最大转速离心5min,用巴斯德吸管或装有一次性蓝吸头的微量移液器小心吸去管中的上清。 警惕：上淸中含大部分未掺入的[γ-32P]ATP。磷酸化反应常使用大于100uCi的放射性标记ATP，因此上清中放射性剂量相当可观，应小心谨慎处理未掺入的放射性物质、移液器吸头及离心管。 5.在管中加入500ul蒸馏水，振荡20s,再次按步骤4离心。 6.吸去管中上清，加入500ul乙醇-乙酸钠溶液，振荡15s，随后在室温下以最大转速离心2min。 7.重复步骤6。 8.小心吸去上清。打开离心管盖，放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后，直到剩余可见的乙醇挥发干净。用20~50ulTE(pH7.6)溶解沉淀的寡核苷酸。如放射性标记的寡核苷酸用作探针，则用小体积预杂交液溶解。 |
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发布于 ： 2021-08-10
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