【讨论】再谈免疫组织化学Triton X100破膜和二抗封闭原理问题
2021-07-20
问题描述：
最近一直关注免疫荧光，几个问题问一下：
第一：tritonX-100破膜的原理到底是什么，我以前看过的资料是它是个脂溶性的东东，可以溶解细胞膜和核膜的脂质，从而形成孔洞，让抗体进入，所以有人说tritonx-100又叫打孔剂。一般用0.3%的浓度，PBS稀释。
但是总有人问我，如果是膜蛋白染色，破不破膜？
如果是膜蛋白，要看抗体和抗原的结合位点，如果是跨膜蛋白的话，其结合位点在胞内段的话肯定是需要破膜的。
根据上面的理解，破膜并不会对蛋白造成影响，只是溶解了脂质形成“孔”。
所以我觉得如果条件允许，常规每次都破一下，还是很好的选择。
你的理解是什么呢？
第二：二抗封闭原理的问题。
上一抗之前都要用二抗来源的血清封闭，那么封闭的原理到底是什么。
看资料说是封闭样品中能够与二抗发生非特异性结合位点，降低非特异性显色。用的封闭液是二抗来源的血清。
我的理解：二抗也是抗体，通常用的是说是和一抗的fc端特异性结合的IgG。
如果是减少非特异性结合的话，那么应该是二抗能够跟样品中的某些东西反应，而二抗来源的血清能先进行阻断。
我的问题是：样品中到底是什么物质，可以和二抗来源的血清中的什么物质，进行结合从而阻断。（即样品中，和二抗来源的血清中，分别是两种什么物质发挥作用）；
但是一个新的问题产生了，大家一般多用的是BSA封闭，BSA叫做牛血清白蛋白，他是如何起到封闭作用的呢？
第三：最近做免疫荧光，一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。
本来我怀疑是抗原弥散了，但是细胞是固定过了的啊，而且同样的方法染色另外一个胞浆表达的抗体，就没有这个问题。
白死不得其解，快要愁死了。
谢谢，请大家指导！
@wh2008
@byd123
@skyskytotop
@甲醛
@多聚甲醛
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janty123
用户
对于上述问题讨论的焦点，本人通过自己的实例来阐述其中必然存在的重要问题。首先打孔其实是没那么神话的东西，因为其实往往影响免疫学染色结果的（包括IHC,IHC-F,IF）重要因素是你的抗原固定的选择和固定的程度。对于常规使用的10%福尔马林和4%PFA（多聚甲醛）来说，有一个必然的结果就是当你觉得固定的越充分的时候，就越难出结果。原因，在于尽管PFA不像10%福尔马林那样会对抗原形成很强的封闭作用（封闭的原因在于甲醛能和抗原形成结合键，从而封闭抗原，这也是为什么石蜡切片为什么往往需要抗原修复的原因），但是这种现象也时常发生。举例，我第一次用4%PFA固定的小鼠肿瘤标本是在室温下，而且只固定了12小时作用（4℃），但是几乎在不打孔的情况下，我可以很轻松的做出很多抗体（不打孔，不修复，而且抗体用的极少1:200，说明书建议为1:50），而且结果还可以，尽管有少数看着不是非常特异。而在第二批标本中，为了我以为的能延长标本在-80℃的保存时间，我“改进”了固定的时间（室温，固定18小时），结果同样的条件，同样的抗体，到1:50的时候才勉强能做出来（抗体是CD31），这正好说明了上述问题，固定越充分那么抗体就会越难做。在给予0.2% Triton-X100 打孔后，结果略微有所改善，者说明打孔并不是一个能充分解决这个问题的方法。同样的道理，在抗原暴露不充分的情况下，有些不像CD31这样有明确形状式定位的抗体的结果是否特异是很难判断的，所以很多时候的免疫荧光结果是有问题的，只是我们并没有去深究罢了，就像文献里往往能做出超级漂亮的结果，而我们的定位总是隐隐约约和他们的有些许的不一样，原因可能就在于此。所以这里我再次声明，Triton-X100对结果的影响是甚微的，也许它能增强结果，但是反应的不一定是最真实的抗原定位结果。所以我建议，大家可以尝试 抗原修复，对于冰冻切片，4%PFA固定的片子，可以选择比石蜡抗原修复缩短30%时间的方法来进行，并且这样会很省抗体，道理很简单，都是检测抗原位点，凭什么IF的抗体稀释比总是比IHC高出这么多，原因可能就在于此。希望大家能做出漂亮的结果。
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byd123
用户这个帖子很好。第一个问题，wan版说得很好。1.理论上来说：1）对于核蛋白，是必须打孔的。2）对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此一举。3）对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。2.在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在结合位点在胞内的蛋白也可能着色。3.如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。实在不知道，就打孔吧，因为不影响实验结果。第二个问题，除了技术支持所说的，还有一个因素。假设一抗是从动物一中得来的，二抗是从动物二中得来的。在二抗的制备过程中，不可避免含有动物二的自身抗体。而这些自身抗体可能与样本的非特异抗原结合形成非特异着色。如果在二抗孵育前，先用来自二抗来源的血清封闭，二抗来源的血清含有动物二的自身抗体。那么，这些自身抗体就会与样本的非特异抗原先结合。再加二抗后，则会大大减少二抗中自身抗体与样本的非特异抗原结合的机会。BSA成分单一，也不含有动物二的自身抗体，封闭效果就不如二抗来源的血清。第三个问题，影响因素较多。1.不同细胞的固定方法，对实验结果确有影响。建议用4%多聚甲醛。2.对于确定只在细胞膜结合的蛋白，可以不用tritonX-100破膜。缩短孵育时间，减少抗体浓度，增加清洗时间等等，都可以减少非特异着色。3.如果经过反复调整实验流程，仍有非特异着色，考虑是抗体问题。
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步行中
用户谈一点个人了解，供您参考:1破膜是非必需步骤，所以理解不必把它当常规。2封闭主要是封闭蛋白与蛋白间的非特异性结合，所以多数情况下可用BSA。3会不会是抗体质量问题？
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wanliheng
用户请看来自LifeTechnologies技术支持的解答，供大家参考。life的技术支持，此次解答是赵静老师回答的，一并表示感谢。首先关于第一个问题，您的理解是非常正确的。第二个关于封闭的问题，因为血清中含有多种的蛋白或者IgG，在加一抗、二抗之前与样本先孵育，可以借用血清中的蛋白或者免疫球蛋白IgG等，将样本中能够与蛋白或者IgG等结合的位点先占据，这样在加一样、二抗的时候，一抗和二抗就更多是去识别特异的位点，而不会与样本的其他无关位置有非特异性结合。选择与二抗来源一致的血清封闭，是为了避免二抗与封闭的血清中的成分再次发生非特异性结合。至于BSA也是类似的原理，不过因为其中的成分单一，所以相对来说封闭的效果是不如血清的。关于第三个问题，这种情况大多是因为细胞固定的方法引起的，请问您是采用的哪一种的固定方法，针对您的这种抗体，您可以考虑改变固定方法，如用多聚甲醛，冰丙酮，甲醇或者甲醇与丙酮不同配比等，您可以上网百度一下“不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响”，应该可以搜索到不同固定方法的建议，调整一下会有改善的。希望以上信息有所帮助，如有其它技术问题，欢迎继续联系我们。
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wanliheng
用户步行中谈一点个人了解，供您参考:1破膜是非必需步骤，所以理解不必把它当常规。2封闭主要是封闭蛋白与蛋白间的非特异性结合，所以多数情况下可用BSA。3会不会是抗体质量问题？关于第1和第2个问题，请看life的解答，供你参考。第3个问题，也有可能是抗体质量的问题，但是我估计换抗体是不可能了。我决定试试其他的固定方法。感谢参与讨论！
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wanliheng
用户以下是sigma的技术支持的回复，供大家参考：此次解答的是许颖老师，一并感谢。1.TritonX-100：您对于Triton的作用理解是准确的，其目的就是在细胞膜上打孔，以让抗体能够顺利进入胞内或核内。对于抗原表位暴露在细胞膜外的膜蛋白，是可以直接检测，不需Triton处理，但是由于蛋白是在胞内合成，Triton处理后，也可检测到胞浆中尚未转移到膜上的蛋白。同时，考虑到后续的染核等操作，Triton通透处理还是需要的。2.封闭液：封闭的作用在于将片子中没有结合细胞或者蛋白的空白部位也结合上蛋白，因为在细胞爬片的过程中，不会完全覆盖片子，即时细胞数很多，也有可能会有间隙，空白部位会非特异地结合一抗，从而增加背景染色，不是因为样品与二抗之间有特异反应，基于此，用不与一抗和二抗反应的蛋白即可达到封闭目的，所以用二抗来源的血清或者BSA都可以用于封闭。3.在IF实验流程与操作没有问题的情况下，更换新的样本或细胞，反复出现非特异性染色，建议更换其它来源或货号的抗体，看是否正常；因为细胞是三维结构，而IF看到的是二维，有可能目的蛋白正好处于核的正面或背面，看着像在核内；另外该蛋白虽然是胞浆蛋白，是否结合在核膜上；如果以上都不是，那么建议更换抗体试试。
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赵艳19870125
用户感谢上述分享，又让我长见识了。我之前没有破膜的细胞，对染核没有什么影响的，个人认为检测膜蛋白不破膜是可行的
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wanliheng
用户以下是amyjet的技术支持的回复，供大家参考：具体如下：1.我建议您可以不用打孔，直接做免疫荧光，可以用比常规低的浓度，短时间打孔。因为实验本身是要不断摸条件的，您可以采取不同方法，找到最好的条件2.样品中含有一些能够和一抗或者二抗结合的非特异性位点，比如Fc受体，这时候加入蛋白封闭住这些位点就会减少非特异性结合。用bsa如果用二抗来源的血清更好。bsa在IF的作用和它在wb中的作用类似，起一个封闭的作用3.这可能是抗体浓度高，封闭时间短，一抗孵育时间长导致的非特异性结合。建议您吧一抗调到最高稀释比例，4度封闭过夜，一抗常温1h
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byd123
用户这个帖子很好。第一个问题，wan版说得很好。1.理论上来说：1）对于核蛋白，是必须打孔的。2）对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此一举。3）对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。2.在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在结合位点在胞内的蛋白也可能着色。3.如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。实在不知道，就打孔吧，因为不影响实验结果。第二个问题，除了技术支持所说的，还有一个因素。假设一抗是从动物一中得来的，二抗是从动物二中得来的。在二抗的制备过程中，不可避免含有动物二的自身抗体。而这些自身抗体可能与样本的非特异抗原结合形成非特异着色。如果在二抗孵育前，先用来自二抗来源的血清封闭，二抗来源的血清含有动物二的自身抗体。那么，这些自身抗体就会与样本的非特异抗原先结合。再加二抗后，则会大大减少二抗中自身抗体与样本的非特异抗原结合的机会。BSA成分单一，也不含有动物二的自身抗体，封闭效果就不如二抗来源的血清。第三个问题，影响因素较多。1.不同细胞的固定方法，对实验结果确有影响。建议用4%多聚甲醛。2.对于确定只在细胞膜结合的蛋白，可以不用tritonX-100破膜。缩短孵育时间，减少抗体浓度，增加清洗时间等等，都可以减少非特异着色。3.如果经过反复调整实验流程，仍有非特异着色，考虑是抗体问题。
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butterflower
用户受益非浅，看来了解二抗来源同样很重要。
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mybbff
用户对于胞内蛋白固定4%比较好，但是对于胞膜蛋白我认为1%比较好。PFA
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wanliheng
用户mybbff对于胞内蛋白固定4%比较好，但是对于胞膜蛋白我认为1%比较好。PFA为什么呢？经验？
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赵艳19870125
用户免疫荧光双标时为什么有的细胞有荧光，有的没有，单标时都可以标上的？非常感谢大家的帮助！
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zhiyong111
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janty123
用户对于上述问题讨论的焦点，本人通过自己的实例来阐述其中必然存在的重要问题。首先打孔其实是没那么神话的东西，因为其实往往影响免疫学染色结果的（包括IHC,IHC-F,IF）重要因素是你的抗原固定的选择和固定的程度。对于常规使用的10%福尔马林和4%PFA（多聚甲醛）来说，有一个必然的结果就是当你觉得固定的越充分的时候，就越难出结果。原因，在于尽管PFA不像10%福尔马林那样会对抗原形成很强的封闭作用（封闭的原因在于甲醛能和抗原形成结合键，从而封闭抗原，这也是为什么石蜡切片为什么往往需要抗原修复的原因），但是这种现象也时常发生。举例，我第一次用4%PFA固定的小鼠肿瘤标本是在室温下，而且只固定了12小时作用（4℃），但是几乎在不打孔的情况下，我可以很轻松的做出很多抗体（不打孔，不修复，而且抗体用的极少1:200，说明书建议为1:50），而且结果还可以，尽管有少数看着不是非常特异。而在第二批标本中，为了我以为的能延长标本在-80℃的保存时间，我“改进”了固定的时间（室温，固定18小时），结果同样的条件，同样的抗体，到1:50的时候才勉强能做出来（抗体是CD31），这正好说明了上述问题，固定越充分那么抗体就会越难做。在给予0.2%Triton-X100打孔后，结果略微有所改善，者说明打孔并不是一个能充分解决这个问题的方法。同样的道理，在抗原暴露不充分的情况下，有些不像CD31这样有明确形状式定位的抗体的结果是否特异是很难判断的，所以很多时候的免疫荧光结果是有问题的，只是我们并没有去深究罢了，就像文献里往往能做出超级漂亮的结果，而我们的定位总是隐隐约约和他们的有些许的不一样，原因可能就在于此。所以这里我再次声明，Triton-X100对结果的影响是甚微的，也许它能增强结果，但是反应的不一定是最真实的抗原定位结果。所以我建议，大家可以尝试抗原修复，对于冰冻切片，4%PFA固定的片子，可以选择比石蜡抗原修复缩短30%时间的方法来进行，并且这样会很省抗体，道理很简单，都是检测抗原位点，凭什么IF的抗体稀释比总是比IHC高出这么多，原因可能就在于此。希望大家能做出漂亮的结果。
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caatt
用户展开引用janty123对于上述问题讨论的焦点，本人通过自己的实例来阐述其中必然存在的重要问题。首先打孔其实是没那么神话的东西，因为其实往往影响免疫学染色结果的（包括IHC,IHC-F,IF）重要因素是你的抗原固定的选择和固定的程度。对于常规使用的10%福尔马林和4%PFA（多聚甲醛）来说，有一个必然的结果就是当你觉得固定的越充分的时候，就越难出结果。原因，在于尽管PFA不像10%福尔马林那样会对抗原形成很强的封闭作用（封闭的原因在于甲醛能和抗原形成结合键，从而封闭抗原，这也是为什么石蜡切片为什么往往需要抗原修复的原因），但是这种现象也时常发生。举例，我第一次用4%PFA固定的小鼠肿瘤标本是在室温下，而且只固定了12小时作用（4℃），但是几乎在不打孔的情况下，我可以很轻松的做出很多抗体（不打孔，不修复，而且抗体用的极少1:200，说明书建议为1:50），而且结果还可以，尽管有少数看着不是非常特异。而在第二批标本中，为了我以为的能延长标本在-80℃的保存时间，我“改进”了固定的时间（室温，固定18小时），结果同样的条件，同样的抗体，到1:50的时候才勉强能做出来（抗体是CD31），这正好说明了上述问题，固定越充分那么抗体就会越难做。在给予0.2%Triton-X100打孔后，结果略微有所改善，者说明打孔并不是一个能充分解决这个问题的方法。同样的道理，在抗原暴露不充分的情况下，有些不像CD31这样有明确形状式定位的抗体的结果是否特异是很难判断的，所以很多时候的免疫荧光结果是有问题的，只是我们并没有去深究罢了，就像文献里往往能做出超级漂亮的结果，而我们的定位总是隐隐约约和他们的有些许的不一样，原因可能就在于此。所以这里我再次声明，Triton-X100对结果的影响是甚微的，也许它能增强结果，但是反应的不一定是最真实的抗原定位结果。所以我建议，大家可以尝试抗原修复，对于冰冻切片，4%PFA固定的片子，可以选择比石蜡抗原修复缩短30%时间的方法来进行，并且这样会很省抗体，道理很简单，都是检测抗原位点，凭什么IF的抗体稀释比总是比IHC高出这么多，原因可能就在于此。希望大家能做出漂亮的结果。......请问您做细胞免疫荧光是用4%PFA固定吗？一般固定多久？做双标的话，一个蛋白定位在胞膜，一个在胞质，需要triton吗？打算都试试。。
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janty123
用户cAATt请问您做细胞免疫荧光是用4%PFA固定吗？一般固定多久？做双标的话，一个蛋白定位在胞膜，一个在胞质，需要triton吗？打算都试试。。关于你说的问题，固定时间一般不能太长，固定12小时4摄氏度就够了，如果害怕固定太过，可以降低PFA浓度到3%，也有用2%的。关于这个问题，我的建议是可以同时设置一张打孔和不打孔的观察下结果是否定位正常，可以先用0.1%试试，如果打孔太过，可以降低到0.05%，或者缩短时间到10分钟以下。再就是Triton最好现配。从原理上来说，一个膜定位和一个浆定位，小浓度打孔（《0.01%）不会太影响结果，当然还要看你片子固定的情况了。
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caatt
用户展开引用janty123关于你说的问题，固定时间一般不能太长，固定12小时4摄氏度就够了，如果害怕固定太过，可以降低PFA浓度到3%，也有用2%的。关于这个问题，我的建议是可以同时设置一张打孔和不打孔的观察下结果是否定位正常，可以先用0.1%试试，如果打孔太过，可以降低到0.05%，或者缩短时间到10分钟以下。再就是Triton最好现配。从原理上来说，一个膜定位和一个浆定位，小浓度打孔（《0.01%）不会太影响结果，当然还要看你片子固定的情况了。......今天又做了，固定的话我用了室温20min。明天看看结果。。原来还可以过夜固定？表示还没试过。。
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janty123
用户cAATt今天又做了，固定的话我用了室温20min。明天看看结果。。原来还可以过夜固定？表示还没试过。。过夜修复4°的话，应该还可以，室温就够呛了，可能固定的会比较过，反倒不利于最后染色。即使4°固定也不能太久。
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liuqin90
用户为什么我在文献上看到细胞爬片固定时间是4%多聚甲醛室温下15min?差别好大。。。看了半天也没明白到底破膜是不是必需的啊?
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tjxh
用户展开引用janty123对于上述问题讨论的焦点，本人通过自己的实例来阐述其中必然存在的重要问题。首先打孔其实是没那么神话的东西，因为其实往往影响免疫学染色结果的（包括IHC,IHC-F,IF）重要因素是你的抗原固定的选择和固定的程度。对于常规使用的10%福尔马林和4%PFA（多聚甲醛）来说，有一个必然的结果就是当你觉得固定的越充分的时候，就越难出结果。原因，在于尽管PFA不像10%福尔马林那样会对抗原形成很强的封闭作用（封闭的原因在于甲醛能和抗原形成结合键，从而封闭抗原，这也是为什么石蜡切片为什么往往需要抗原修复的原因），但是这种现象也时常发生。举例，我第一次用4%PFA固定的小鼠肿瘤标本是在室温下，而且只固定了12小时作用（4℃），但是几乎在不打孔的情况下，我可以很轻松的做出很多抗体（不打孔，不修复，而且抗体用的极少1:200，说明书建议为1:50），而且结果还可以，尽管有少数看着不是非常特异。而在第二批标本中，为了我以为的能延长标本在-80℃的保存时间，我“改进”了固定的时间（室温，固定18小时），结果同样的条件，同样的抗体，到1:50的时候才勉强能做出来（抗体是CD31），这正好说明了上述问题，固定越充分那么抗体就会越难做。在给予0.2%Triton-X100打孔后，结果略微有所改善，者说明打孔并不是一个能充分解决这个问题的方法。同样的道理，在抗原暴露不充分的情况下，有些不像CD31这样有明确形状式定位的抗体的结果是否特异是很难判断的，所以很多时候的免疫荧光结果是有问题的，只是我们并没有去深究罢了，就像文献里往往能做出超级漂亮的结果，而我们的定位总是隐隐约约和他们的有些许的不一样，原因可能就在于此。所以这里我再次声明，Triton-X100对结果的影响是甚微的，也许它能增强结果，但是反应的不一定是最真实的抗原定位结果。所以我建议，大家可以尝试抗原修复，对于冰冻切片，4%PFA固定的片子，可以选择比石蜡抗原修复缩短30%时间的方法来进行，并且这样会很省抗体，道理很简单，都是检测抗原位点，凭什么IF的抗体稀释比总是比IHC高出这么多，原因可能就在于此。希望大家能做出漂亮的结果。......细胞爬片，室温4%多聚甲醛固定，但是固定后没有立即进行后续免疫荧光。然后爬片置于PBS中4度保存，一周后还能用吗
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素珉
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wenshl2005
用户最近有人用DMSO加甘油透明，在某些组织中效果很好。
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pengdu9
用户wenshl2005最近有人用DMSO加甘油透明，在某些组织中效果很好。请问浓度及作用时间？以及哪些组织呢？再请教各位大神，有做过全组织免疫荧光的吗？就是整个组织块不包埋，固定半小时之后即开始免疫荧光各步骤。最后共聚焦观察。文献当中没有详细描述透明化处理的步骤，如果想要染组织块中央的细胞，该如何操作呢？
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wenshl2005
用户pengdu9请问浓度及作用时间？以及哪些组织呢？再请教各位大神，有做过全组织免疫荧光的吗？就是整个组织块不包埋，固定半小时之后即开始免疫荧光各步骤。最后共聚焦观察。文献当中没有详细描述透明化处理的步骤，如果想要染组织块中央的细胞，该如何操作呢？这个方法不是我整的，他们要发文章，我也不好意要配方和方法。没做过大组织的荧光。pengdu9wrote请问浓度及作用时间？以及哪些组织呢？再请教各位大神，有做过全组织免疫荧光的吗？就是整个组织块不包埋，固定半小时之后即开始免疫荧光各步骤。最后共聚焦观察。文献当中没有详细描述透明化处理的步骤，如果想要染组织块中央的细胞，该如何操作呢？
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cyclemouse
用户mark
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cyclemouse
用户感谢分享！！
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CavinChan
用户mark
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龙猫3号
用户楼主您好！请问，对小鼠组织进行免疫组化染色时，如果选用小鼠抗小鼠的一抗，羊抗小鼠的二抗，使用正常山羊血清做封闭，是否可封闭掉小鼠组织内原有的IgG？
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wanliheng
用户龙猫3号楼主您好！请问，对小鼠组织进行免疫组化染色时，如果选用小鼠抗小鼠的一抗，羊抗小鼠的二抗，使用正常山羊血清做封闭，是否可封闭掉小鼠组织内原有的IgG？理论上没有问题。但是根据抗体的特异性等关系，可能不一定很完美封闭。实践是检验真理的唯一标准祝好！推荐单克隆抗体。
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龙猫3号
用户感谢回复。一抗用的是单克隆抗体，但这跟如何去除组织里原本存在的Ig干扰应该没什么关系啊…求教。
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谢云鹤1992
用户MARK
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