材料

缓冲液和溶液

各种贮存液，缓冲液和试剂成分请参阅附录1。
将贮存液稀释至所需的浓度。

ATP(10mmol/L)

10xPE1缓冲液
200mmol/L                              Tris-Cl(pH7.5)
100mmol/L                                MgCl₂
500mmol/L                                 NaCl
10mmol/L                                       DTT

10XPE2缓冲液
200mmnl/L                                      Tris-Cl(pH7.5)
100mmol/L                                      MgCl₂
100mmol/L                                       DTT

酶和缓冲液

噬菌体T4DNA连接酶

噬菌体T4多核苷酸激酶

大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段
延伸反应可使用任意一种DNA聚合酶（步骤4和5)。Klenow片段缺乏5端外切核酸酶活性，因此不能降解模板。然而,其他酶例如噬菌体T4DNA聚合酶(Nossal1974,Geisselsoderetal.1987);天然的T7DNA聚合酶（BebenekandKunkel1989)以及测序酶Schena1989,Venkitaiamanl989)薄要较短的孵育时间。当磷酸化的诱变寡核苷酸被用做聚合反应或延伸反应单一引物时必须使用这些酶。不像Klenow片段，无论测序酶或天然的由噬菌体T4和T7编码的DNA聚合酶都不能从模板上置换诱变寡核苷酸（Nossal1974，Kunkel1985，BebenekandKunkel1989，Schena1989)。

核酸和寡核苷酸

M13噬菌体通用测序引物
任何商业化的以M13单链噬菌体正链为模板用于引导DNA双脱氧测序反应的通用引物均适用于本方法。

含4种dNTP的dNTP溶液，每一种dNTP的浓度为2mmol/L。
使用高质量的dNTP以降低污染的dUTP掺入到DNA新合成链中的几率。我们认为Pharmacia公司生产的浓缩dNTP溶液效果良好。

诱变的M13噬菌体单链DNA模扳

诱变的寡核苷酸引物
应按照信息栏关于诱变寡核苷酸专题的所述设计诱变寡核苷酸。在定点诱变前用Sep-PakC18柱屋析纯化诱变寡梭苷酸去除盐和其他杂质（请见第10章方案6)。除非寒核苷酸长度超过30个梭苷酸或将被用于环入或去环诱变，否则不需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸。

培养液

2XYT顶层琼脂平板和YT琼脂平板

专用设备

Falcon2059试管（预冷）或电击杯

47°C加热块或水浴

16°C、42°C和68°C水浴

适合变性温度的水浴，
请见步骤3,热循环仪亦可用于上述步骤中。

其他试剂

步骤1所需要的试剂列在本章方案1中。

步骤7所需要的试剂列在第12章方案3和4中。

步骤7所需要的试剂列在本章方案7中。

载体和菌株

请见附录3

适用于转化的大肠杆菌菌株（例如，TG1)

用于转化的大肠杆菌TG1感受态菌。
感受态细胞制备见第1章方某25和26。

大肠杆菌菌株TG1过夜培养物

方法

1.按方案1所描述的方法制备M13噬菌体单链模板。用离心柱层析纯化含尿嘧啶的模板。

2.用噬菌体T4多核苷酸激酶对诱变体寡核苷酸和通用测序引物进行磷酸化，在不同的微量离心管中混合下列物质：

合成的寡核苷酸                                           100~200pmoles

10X噬菌体T4多核苷酸激酶缓冲液         2ul

10mmol/LATP                                                   1ul

噬菌体T4多核苷酸激酶                                    4单位

加水至20ul

37°C孵育反应1h,然后68°C加热10min灭活多核苷酸激酶。

3.将磷酸化的诱变寡核苷酸和通用测序引物与含靶序列的单链M13噬菌体DNA复性。混合下列反应物：

单链模板DNA(-1ug)                          0.5pmole

磷酸化的诱变寡核苷酸                                  10pmoles

磷酸化的通用引物                     10pmoles

10XPF11缓冲液                                             1ul

加水至10ul

在高于诱变寡核苷酸完全杂交的理论Tm值20°C以上的温度加热上述混合物5min,计算Tm值的公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T),(G+C)是寡核音酸中G和C残基的总和，（A+T)是寡核苷酸中A和T残基的总和。将含有反应混合物的离心管转移至一个装有水的而且水温高于Tm值20°C以上的烧杯中。将烧杯放置在工作台上，待其缓慢冷却至室温（~20min)。在微型离心机上稍微离心（5s)收集所有的管壁上的冷凝液。
或者，加热或冷却核酸和寡核苷酸的操作可在热循环仪中进行。引物对模板的摩尔浓度比应为10:1或50:1使用过多的引物将增加靶DNA的异位突变频率。

4.当退火反应冷却到室温时，将下列试剂混合在一新的0.5ml的微量离心管中。

10XPE2缓冲液               1.0ul
2mmol/LdNTP溶液          1.0ul
10mmol/LATP                1.0ul
噬菌体T4DNA连接酶     5Weiss单位
Klenow片段              2.5单位

将上述混合物置于冰上备用。
当使用噬菌体T4DNA聚合酶或测序酶时，在0°C孵育聚合/延伸反应（步骤5)5min，室温孵5min,然后在37°C孵育2h。低温孵育有利于合成从3端DNA起始，后来在37°C孵育可提高延伸反应的效率。另外，应将反应中4种dNTP每一种的浓度增加至500umol/L。这将显著增加延伸反应效率，并强烈抑制噬菌体T4DNA聚合酶的3端外切核酸酶活性。

5.把10ul冰冷的步骤4反应混合物加入到含单链DNA和退火的寡核苷酸的混合物中(步骤3)。16°C孵育该最终反应混合物6~15h。

6.按以下步骤转染合适的感受态大肠杆菌宿主菌（例如TG1)

a.用10mmol/LTris-Cl(pH7.6)对反应混合物进行系列稀释（1:10,1:100,1:500)。

b.准备一系列预冷的（0°C)Falcon2059离心管，(i)分別把1ul、5ul原始反应混合物和（ii)1ul、5ul各种稀释度的反应混合物转移到离心管中。每个离心管中加入200ul感受态TG1细胞制备物。

c.将上述混合溶液置于冰上30min,再转移到42°C水浴中准确保温2min。

d.从42°C水浴中取出反应物，加入100ulTGl过夜培养细胞。加入过量的细胞更易观察在菌苔中生长的M13噬菌斑。

如果步骤b中使用新制备的TG1细胞而不是冷冻的感受态细胞则不需要额外加入TG1细胞。

e.每只离心管中加入2.5ml2xYT顶层琼脂（融化并冷却至47°C),混合后铺在YT琼脂平板顶层。37°C孵育平板12~16h待噬菌斑形成。
也可以用电击法把突变的DNA导入大肠杆菌。电击法的转染频率通常比正常转染方法髙出许多，因此在电击前应将每份诱变反应混合物用水进行1/100;1/500;1/1000和1/10000倍系列稀释.分别取1~10ul稀释液进行电击。



7.通过对单链噬菌体DNA测序方法筛选噬菌斑（请见第12章方案3和4)。如需要,可通过放射性同位素标记的寡核苷酸探针筛选低频率出现的突变体。