PET系统:经典的原核蛋白表达系统
PET系统：经典的原核蛋白表达系统
说到重组蛋白的表达，借鉴集体的智慧很重要，而发表技术进展的著名期刊naturemethods是业内广为推广的经验之源。近期的一篇综述（naturemethods5,135-146）总结了来自14个进行专业高通量重组蛋白表达的83个研究者的表达工作，推广了他们在用于基因功能研究的蛋白表达方面的成功经验。在目的基因克隆策略，选择和优化表达宿主，启动子，融合标签。纯化方法等环节，已经确立通用的重组蛋白表达策略，并在为数众多的蛋白表达实践中获得了很好的效果。
在基因克隆阶段，文章提及的14个实验室中有9个采用了NOVAGEN创新的LIC不依赖连接反应的克隆方法（LIGATION-INDEPENDENTCLONING，详情请参考右页）。14个实验室中12个选择了T7RNA聚合酶控制的PET表达载体。表达宿主中常用的是BL21（DE3），一种带有XDE3溶原的BL21细胞，其中LON和OMPT蛋白酶缺陷型有助于提高蛋白的稳定性和产量。这些实验室都有用能够补充稀有密码子的ROSETTADE3和TOSETTA2DE3菌成功表达真核蛋白的经验和报告。细胞裂解和样本处理采用BENZONASE核酸酶和BUGBUSTER蛋白抽提试剂有利于提高蛋白产量和整体效果。而在细胞培养的发酵环节，自动诱导培养基是高通量表达项目必备工具。NOVAGEN的OVERNIGHTEXPRESS系列自动诱导系统可以使细胞由生长到表达不再需要加入IPTG等诱导剂。至于融合标签的选择，目前还是HIS。TAG因相应的IMAC纯化方法（固定化金属离子亲和纯化）最常用而在绝大多数蛋白表达时被选为融合标签。
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发布于 ： 2021-08-15
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