小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)ELISA检测试剂盒
| 实验材料 | 基因组DNA 试剂、试剂盒 | 蛋白酶KRNA酶双蒸水NaOH对苯二酚 仪器、耗材 | 紫外分光光度计水浴锅亚硫酸氢钠EP管铝箔纸移液枪 实验步骤 | 一、基因组DNA的提取 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。 3. 验证提取DNA的纯度的方法有二： （1）紫外分光光度计计算OD比值； （2）1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 二、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1. 将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2. 加5.5ul新鲜配制的3MNaOH； 3. 42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4. 10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）。 5. 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3MNaOH滴定溶液至pH5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。pH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6. EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7. 加200ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8. 50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： （1）基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 （2）所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 （3）亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。 （4）水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。 三、修饰后DNA纯化回收 EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。 1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。 2. 以下使用PromegaWizardCleanupDNA纯化回收系统（Promega，A7280） （1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇； （2）加1mlPromega’sWizardDNAClean-upresin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合； （3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml~5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。 （4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。 （5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。 （6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。 （7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。 3. 加5.5ul新鲜配制的3MNaOH，室温放置15min。 4. 加33ul10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。 5. 加4ul10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。 6. 加270ul冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧。 7. 4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。 8. 加500ul70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。 9. 倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul~30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。 10. -20℃保存DNA溶液。 此步细节： （1）在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。 （2）乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。 （3）异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。 此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的pH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。 四、修饰后DNA用于PCR 这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题： 1. 引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。 2. Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LATaq，很好用，配有10x含mg2+的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。 3. PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。 4. 做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。 5. PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。 五、PCR产物的凝胶回收 这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。 几个细节： 1. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。 2. 凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。 3. 紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。 4. 回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。 六、PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选 1. 连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒） 15ul体系 T-easy1ul Ligase1ul 2×buffer7.5ul DNA5.5ul 4度，过夜。 2. 连接产物的转化 （1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上； （2）连接产物15ul全部加入，至于冰上30分钟； （3）42度，90秒钟； （4）冰上2分钟； （5）800ulLB培养基； （6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）； （7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100~150ul； （8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基） 先涂：X-gar35ul IPTG25ul 后涂：混悬液 过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。 3. 取白斑，划种于新板上 新板：先涂：X-gar35ul IPTG25ul 然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。 针头挑白斑划2道于板上相应区域内。 37度，孵箱过夜。 4. 联系测序公司送测序。一般一个克隆在35~45元。 这一部分的细节： （1）涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上； （2）不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。 |
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发布于 ： 2021-08-15
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