请教高手：克隆基因的步骤？
2021-08-12
问题描述：
我刚考上硕士，导师就让我克隆一个基因，可我啥也不会，怎么办？
我已经知道了这个基因在其他物种中的序列和它所编码的蛋白质的序列，导师的意思是让我把它在大豆中克隆出来。我该怎么办？
听导师说，可能要用到RT-PCR。谁能帮帮我？
感激不尽啊！
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Lecanii
用户
大脑战友：不要着急，我认为你可以从以下几个方面着手你的实验：1）首先你要把其他物种中的序列和它所编码的蛋白质的序列在NCBI中搜索一下，并分析它们的基因和蛋白质有没有保守的区域，如果它们的保守性非常好的话，你就可以根据它们的序列来设计上下游引物，提取大豆的DNA作为模板，进行PCR扩增就可以得到你所需要的基因； 2）如果你的基因和蛋白质在NCBI上的同源性比较小，要克隆你的基因就困难的多，首先你要构建大豆的基因组文库，并根据你的蛋白质保守区域设计探针，然后在基因组文库中进行筛选，这样做可能需要很多的时间和精力 3）RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）,和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
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大脑
用户jinkui960哥:小弟现在是感激泣淋啊!
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血吸虫
用户我看老兄应该是想克隆同一基因在不同物种的同源基因，我提供你一个思路：兼并引物RT-PCR,下边是我毕业论文中的一段，希望能对你有些帮助。PCR技术如今已成为分子生物学中的一项常规技术，但一般都是用于扩增已知序列，而简并PCR技术则可以扩增未知序列，故成为寻找和发现“新”基因或基因家族新成员的一种非常有用的工具。简并PCR可以用于搜索一个基因家族的新成员、不同物种的同源基因或相关病毒。简并PCR与常规PCR之间的一个重大差别，就是用简并引物代替具有特定序列的特异的PCR引物。简并引物是依据遗传密码的简并性，从氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。由于大多数氨基酸的遗传密码不止一种，所以引物的部分碱基不能确定，可以根据各种不同的遗传密码规律设定DNA和氨基酸的相互转换，这样设计出来的引物是将可能编码一个给定氨基酸序列的核苷酸组合设计为一组，实际上是多种序列的混合物，序列的大部分是相同的，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。简并寡核苷酸链可独立合成然后混合为库，或者在DNA合成仪的程序中在一个位置放置多个核苷酸。本研究采用后一种方法，合成根据CYP6基因同源区氨基酸序列设计的一对简并引物，进行RT-PCR扩增，来获得嗜人按蚊中CYP6家族的成员。
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大脑
用户回血吸虫兄:老兄说的很有道理,容我回去查查再来:)
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Lecanii
用户你的帖子上的这句话不懂:"进行PCR扩增就可以得到你所需要的基因".扩增之后是不是要测序?这样才能知道我得到的是不是我想要得?也就是说,该如何检测结果?对，引物要自己设计，引物设计你可以利用一些软件，但我觉得比较简单的就是在线免费设计引物的PRIMER3，推荐使用，它的链接如下：http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi进行PCR以后肯定要测序来判断PCR产物是否是你需要的目的基因，大致程序如下：PCR扩增------DNA片段回收------------T-载体连接---------转化宿主菌（一般用大肠杆菌DH5a）--------质粒提取、酶切---------测序---------NCBI比对，判断是否是目的基因。祝好运！
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血吸虫
用户大脑回血吸虫兄:老兄说的很有道理,容我回去查查再来:)很赞赏“大脑”的方式：在论坛上求助，得idea后然后自己再检索。毕竟论坛还是比较自由和非正式的，网友仅仅能提供思路和启发，不能完全靠论坛上的求助来解决所有问题，而且网友提供的回帖也不见得完全正确，需要你自己来判断和分析，因此，根据网友回帖结合自己查找咨询有关资料进一步分析才是有效的办法。研究生教育同时也是科研思路、科研方法的锻炼，不仅仅是为了完成一篇论文或做一点实验，老板在课题方面有关知识的缺乏不见得完全是坏事：可以给你提供自我发挥的空间，同时由于没有依赖，也可以锻炼你独立思考，解决问题的能力。祝“大脑”同志在读研过程中有收获多多。
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