[第一条链cDNA合成] 1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(终浓度1.25mM) Linkerprimer(1.4μl，终浓度100μg/μl) DEPcH2O RNaseblockⅡ(1U/μl)1.0 mRNA1~5μg 混合，离心20秒钟，室温放置10分钟 2．加入逆转录酶至1500U/ml，补水到终体积50μl。 3．混合，取出5μl放入含有0.5μgα-32PdATP（800Ci/mM），分别保温在37℃1小时。 4．保温后，带有同位素的离心管放入-20℃保存，为以后分析用。第一条链cDNA混合物放在冰上。 [第二条cDNA链的合成] 1．对于总体积为45μl的第一条链混合物按下列次序依次加入： 第一条链混合物45.0μl 10×第二条链缓冲液20.0μl 0.1MDTT8.0μl 10mMdNTPMix3.0μl α-32PdATP（800Ci/mM）1.0μl ddH2O115.0μl 2．混合后，加入： RNaseH(4.0U/μl)1.0μl DNA聚合酶（10.0U/μl）7.0μl 第二条链反应体积200μl，在16℃水中保温2.5小时，注意水温不得超过16℃，保温后立即放在冰上。 3．反应混合物随后用酚，氯仿提取 4．用乙醇沉淀于，-20℃过夜。 5．次日，在4℃，以最大速度离心1小时。 6．用80%乙醇洗一次。 7．冷冻干燥cDNA。 8．最后沉淀物溶于43.5μl的ddH2O，取出4.5μl存入冰箱，作为第二条链分析用。 [填补cDNA末端] 1．在39μl的cDNA溶液中加入:5.0μl的10×T4DNA聚合酶缓冲液，2.5mMdNTP混合物。 2．反应物在37℃保温30分钟。 3．酚，氯仿提取。 4．酒精沉淀cDNA，-20℃至少沉淀30分钟。 5．在台式离心机中，以最大速度4℃离心60分钟。 6．80%乙醇洗涤沉淀。 7．冷冻干燥cDNA沉淀。 [连接] 1．在反应总体积10μl中，应有： 1μl10×连接缓冲液 1μl10mMATP 1μl(4WeissU/μl) T4DNA连接酶，连接子或者Adapter 2．反应在8℃保温过夜。 3．保温后，反应离心管放于70℃30分钟，以灭活DNA连接酶。 [cDNA末端磷酸化] 1．70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。 2．在反应混合物（10μl）中加入： 1μl10×连接缓冲液 2μl10mMATP 1μl（10μ）DNA激酶 [限制性内切酶消化]以得到粘性末端 1．限制性内切酶消化DNA和载体。 2．在37℃保温1~5小时，然后冷却到室温，如果选用定向插入，需用两个不同的限制性内切酶消化，可得到两个不同的粘性末端。 [cDNA大小的选择] 1．在50μl的总体积中加入5μl0×STE缓冲液。 2．SephacrylS-400柱收集分离出的cDNA。 3．用酚，氯仿抽提。 4．酒精沉淀之后，悬浮cDNA在10μl的无菌水中。 [cDNA和载体连接]载体可用λgt10,λgt11或λZAPⅡ cDNA(0.1~1μg)2.5μl 10×连接缓冲液0.5μl 10mMαATP0.5μl 载体（1μg/μl）1.0μl T4DNA连接酶（4WeissU/μl）0.5μl 总体积为5μl 12℃保温过夜，或4℃两天，然后放在室温下2小时。 [包装]试剂由Strategene制备 1．包装提取物从-70℃取出立即放入干冰中。 2．同时化解超声提取物（黄色）。令在手指间溶解冻红色管，到刚刚开始化时，加1μlDNA置于冰上。 3．快速加15μl超声提取物到DNA中，仔细混合，避免气泡，在室温下保温2小时（22℃）。 4．加500μl噬斑稀释缓冲液（SM溶液），再加20μl氯仿，温和的混合。 5．离心弃去噬菌体碎片。这个cDNA文库可以测效价，保存于4℃中。 [制备ZAPⅡ文库的单链cDNA] 1．在一个50ml的圆锥形离心管中，加宿主菌250μl到SM液中： SM液：20mMTrispH7.5 100nmNaCl 10nMMgSO4 0.2%Gelatin 2．37℃保温15分钟后，加5ml2×YT（其中每升溶液含10gNaCl,10g酵母提取物，16g胰酶解胨），37℃摇5小时。 3．然后在70℃保温20分钟。 4．4000g离心5分钟，以除去细菌裂解碎片。回收上清液。这里应含有诱导得到的单链重组噬菌体，同样还会有辅助噬菌体。滴度可以按细菌的形成单位来计算。 [大量制备生产单链噬菌体DNA] 1．新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。 2．加1ml含单链cDNA的上清液。 3．再于37℃继续培养2小时。 4．然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。 5．9500rpm离心60分钟，除去细菌碎片。 6．向上清液中加等体积的20%PEG，3.5M醋酸胺溶液，室温下沉淀30分钟。 7．9500rpm离心45分钟，把PEG沉淀悬浮在含有405mg/ml的SM溶液中，23℃35000rpm离心16~24小时，在管上部附近，噬菌斑会形成一个可见带，针刺法收集可见带，并对SM溶液透析，最后以酚、氯仿抽提，酒精沉淀噬菌体DNA。 [生物素标记] 1．取来自一个文库的单链cDNA，先用生物素标记后，再与另一个不加生物素标记的cDNA以10：1进行杂交。 2．生物素标记物来自VectorLaboratories，取100μg的单链DNA溶解在HE缓冲液中，HE缓冲液为：10mMHEPESpH7.5,1MEDTA. 3．100μg/ml超声粉碎。 4．酒精沉淀，溶解在100μlHE缓冲液中。 5．DNA与100μl重组的Photoprobe生物素充分混合。 6．然后暴露在275W的太阳灯下15分钟，混合物与照射距离灯10cm，再重复一次，共30分钟。 7．混合物用正丁醇抽提4次。 8．乙醇沉淀，沉淀物再悬浮于100μlHE缓冲液中。 [差减杂交] 1．100μg的生物素标记的单链cDNA与另一个文库的10μg的未经生物素标记的单链cDNA乙醇共沉淀。 2．加入：5μgPolyA(Pharmacia),5μgPolyC(Pharmacia)，溶解在10μlHE缓冲液中。 3．把这10μl混合物加到10μl杂交混合物中，此杂交混合物含有： 1.5mNaCl 50mMHEPESpH7.5 10mMEDTA 0.2%SDS 总共20μl 4．把样品紧紧地封在一个硅化过的0.75μl的微量离心管中。 5．煮沸1分钟后。 6．浸在68℃水中20小时。 7．杂交后的差减物用Streptavidin-Phenol提取除去杂交的DNA。 8．用乙醇沉淀后再悬浮于20μl2mMTrispH7.5+0.1MEDTA溶液中。 9．取5μl单链cDNA，加： 5pmole的引物1μl 引物粘合缓冲液（20mMTrispH7.5,50mMNaCl）2μl H2O2μl 总体积为10μl 10．68℃保温10分钟，使引物和cDNA粘合，再慢慢冷却至低于30℃，大约需要2小时。 11．10μl的体积稀释到50μl的反应缓冲液中，反应缓冲液组成为：10mMTrispH7.5,7mMMgCl2,1mMDTT,50mMdNTP。 12．加10单位的Klenow聚合酶，37℃保温2小时。 13．反应物用于转化大肠杆菌。转化用LB琼脂糖平板，琼脂平板含有：50μg/ml青霉素，50μl2%的X-gal，100μl0.1MIPTG。 14．用无菌牙签挑出所有白色菌落，于96孔板中，每孔中含有100μlLB培养液并含有100μg/ml青霉素。 15．把96孔板用石蜡膜包好，在37℃摇动过夜。 16．第二天，在每孔中加入100μl高压效度过的50%甘油，再回37℃摇动1小时，96孔板保存在-80℃冷冻箱，稳定1~2年，这就是差减后的cDNA文库。
