从包涵体中纯化表达蛋白_园丁阿秀
实验材料 | 表达靶蛋白的大肠杆菌细胞 试剂、试剂盒 | 细胞裂解缓冲液I细胞裂解缓冲液Ⅱ脱氧胆酸浓盐酸包涵体溶解缓冲液I包涵体溶解缓冲液ⅡKOHPMSFSDS凝胶加样缓冲液含尿素的Tris-ClDNaseI溶菌酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶 仪器、耗材 | SorvallGSA转头或相当的转头pH试纸磨光玻璃棒 实验步骤 | 材料 缓冲液和溶液 贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录1。 贮存液稀释至适当浓度。 细胞裂解缓冲液I 50mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 100mmol/LNaCl 细胞裂解缓冲液Ⅱ,冰冷 50mmol/LTris-Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 100mmol/LNaCl 0.5%TritonX-100 脱氧胆酸 使用蛋白级的胆酸/去污剂。 HCl(12mol/L)(浓盐酸) 包涵体溶解缓冲液I 50mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 100mmol/LNaCl 8mol/L尿素 0.1mol/LPMSF 缓冲液现用现配。 包涵体溶解缓冲液Ⅱ 50mmol/LKH2PO4(pH10.7) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 50mmol/LNaCl KOH(10mol/L) PMSF(100mmol/L) 1x和2XSDS凝胶加样缓冲液 不含DTT的1x和2xSDS凝胶加样缓冲液室溫保存,lmol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。 含尿素的Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5) 仅限于方法2使用,请见步骤7。配制内含尿素浓度递增(如0.5、1、2和5mol/L)的0.1mol/LTris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配,不能使用任何尿素贮存液,因为尿素容易分解。 酶和缓冲液 DNaseI(1mg/ml) 溶菌酶(10mg/ml) 用Tris-Cl(PH8.0)现用现配。 凝胶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%) 用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录8。 离心机和转头 SorvallGSA转头或相当的转头 特别配备 pH试纸 备用,请见步骤10。 磨光玻璃棒 载体和细菌菌株 表达靶蛋白的大肠杆菌细胞 培养1L以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞 方法 制备细胞抽提物 1.1L表达细胞培养物于预先称重的离心管中4°C以5000g(5500r/minSorvallGSA转头)离心15min。 注意:步骤2~4—定要在4°C进行。 2.吸去上清,称菌体沉淀的重量,每克(湿重)菌体加入3ml细胞裂解缓冲液I,轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动,使菌体悬起。 3.每克(湿重)菌体加入4ul100mmol/LPMSF,80ul10mg/ml溶菌酶,搅动20min也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物(见方案1)。 4.每克(湿重)菌体加入4mg脱氧胆酸,继续搅动。 5.悬液37°C放置,不时用磨光玻璃棒搅动,待其变黏时每克(湿重)菌体加入20ul1mg/mlDNaseI。 6.裂解液室温放置,直至不再黏稠(约30min)。 纯化和洗涤包涵体 7.用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。 方法1:用TritonX-100提取包涵体 下述流程是对Marston等(1984)所用方法的改进。 a.细胞裂解物4°C高速离心15min。 b.倾倒去除上清,沉淀重悬于9倍体积的4°C细胞裂解缓冲液Ⅱ。 c.悬液室温放置5min。 d.高速离心15min。 e.倾倒上清,留置待用。沉淀重悬于100ul水。 f.各取10ul上清和沉淀,分别与10ul2XSDS凝胶加样缓冲液混和,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。 g.必要时继续步骤8溶解包涵体。 方法2:用尿素提取包涵体 下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体,摘自Schoner等(1985)。 a.细胞裂解物4°C高速离心15min。 注意:步骤b、d和f必须在4°C进行。 b.倾倒去除上清,每克(湿重)菌体沉淀重悬于1ml水中。每支100ul装4支离心管,其余4°C保存。 c.4°C高速离心15min。 d.毎份沉淀重悬于100ul含不同浓度(如0.5、1、2和5mol/L)尿素的0.1mol/LTris-Cl(pH8.5)。 e.4°C高速离心15min。 f.倾倒上清,留置待用,每份菌体沉淀重悬于100ul水中。 g,各取10ul上清和沉淀,分别与10ul2XSDS凝胶加样缓冲液混和,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。 h.用步骤g确定的最佳浓度,按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀(步骤b)。 i.必要时继续步骤8溶解包涵体。 溶解包涵体 8.取适量步骤7的重悬细胞沉淀,4°C高速离心15min,沉淀重悬于100ul含0.1mmol/LPMSF(现用现加)的包涵体溶解缓冲液I。 9.室温放置lh。 10.把溶液加入到9倍体积的包涵体溶解缓冲液II中,室温放置30min。检査pH是否维持在10.7,必要时用10mol/LKOH调节。 11.用12mol/L盐酸将溶液pH调至8.0,室温放置至少30min。 12.室温高速离心15min。 13.倾倒上清,留置待用,沉淀重悬于100ul1XSDS凝胶加样缓冲液。 14.取10ul上清与10ul2xSDS凝胶加样缓冲液混和,上清和沉淀分别进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析溶解程度,继续附加方案。 |
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发布于 : 2021-07-24
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