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- Protocol
- WashcellswithPBSandtrypsinizetoasinglecellsUSPension.
- Countanaliquotonahemocytometer.Meanwhilecentrifugethecells(e.g.1000RPM,5min.)topelletthem.
- Resuspendthecellstoaconcentrationof2x106cells/samplewithFlowSortsolution.
- Aliquotintoflowsorttubes(maximum3mLpertube)
- Aliquot1.5mLofmediaintofalcontubesforcollection.
- Placecellsandcollectiontubesoniceandtransporttoflowfacility.Alsobringtransferpipetsandextratubes.
- RununtransfectedcellsfirstandsetupvoltageforGFP(FL1)andPIforviABIlity(FL3).
- SortGFP(+),PI(-)cells.Themaximumsortrateisabout5,000totalcells/second.
- Sortforamaximumofonehour.
- Spindowncellsandplate(104/cm2or106cells/P100).
Materials
- GFPtransfectedcells
- Untransfectedcellsasnegativecontrol
- FlowSortsolution:25%media,75%PBSwith2µg/mLpropidiumiodide,10µg/mLDNAse(or10U/mL)
- PBS
- 1xTrypsin/EDTA
- Media
- Flowsorttubes:Falcon#352054
- Steriletransferpipets
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