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DNA连接酶在基因工程方面的用途

DNA连接酶也称DNA黏合酶,在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色,那就是把两条DNA黏合成一条。无论是双股或是单股DNA的黏合,DNA黏合酶都可以借由形成磷酸酯键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。虽然在细胞内也有其他的蛋白质,例如像是DNA聚合酶在其中一股DNA为模版的情况下,将另一边的DNA单股断裂端,通过聚合反应的过程形成磷酸双脂键(phosphodiester bond)来黏合DNA(DNA连接酶将DNA片段缝合起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸双脂键)。但是DNA聚合酶的黏合过程却只是聚合反应一个附带的功能而已,真正在细胞内扮演DNA黏合反应的工作还是以DNA黏合酶为主。DNA黏合酶的功能便是黏合断裂的DNA,而细胞内只有DNA复制与DNA修复的反应牵涉到DNA断裂的合成,因此DNA黏合酶就是在上述的两个机制扮演重要的角色。除了细胞内的黏合反应,随着分子生物学的进展,几乎大多数的分子生物实验室都会利用DNA黏合酶来进行重组DNA的实验,或许这也可以被规类为其另一种重要的功能。

DNA连接酶发现

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的,最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

DNA连接酶性质

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽链。对胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60Ku,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA连接酶用途

DNA连接酶主要用于基因工程,将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合,故也称“基因针